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基于发芽剂与羟自由基协同作用的芽胞灭活技术研究

张林  
【摘要】:细菌芽胞对干燥、射线、生物酶、毒性化学物质、热力等理化因子具有很强的抵抗力。这种抗力主要是归结于其具有坚实的壳质结构、能够与核酸紧密结合的α/β-酸溶性小分子芽胞蛋白以及能够与蛋白质紧密结合的吡啶二羧酸钙(Ca-DPA)成分。与其相应的繁殖体相比,细菌芽胞对理化因素的抵抗作用增长了10-75倍。因此,在生物防护技术研究中,探索并建立可靠、低污染型的现场净化技术是一项迫切任务。 本课题引入透射电镜、荧光分辨、共聚焦扫描、微生物活菌计数和动物毒性试验等技术手段,观察L-丙氨酸发芽剂的生物效应以及与羟自由基(·OH)协同作用灭活类炭疽芽胞的效果。研究结果如下: 1.经最适条件的发芽剂L-丙氨酸作用,电镜下可见发芽20min时的芽胞核心密度降低,核心与皮质、皮质与外壁之间界限模糊,芽胞外壁和芽胞衣有破裂,通透性增加;30min时的芽胞皮质消失,细胞膜基本完全形成,核与胞制质融合。 2.在发芽过程中,随着发芽时间的增加,发芽体对DAPI荧光的摄入增多,染荧光强度不断增加,显示菌体中核酸的活性和含量不断增加。 3.在发芽过程中,芽胞DPA不断流出,与元素铽(Ⅲ)形成的复合物(Tb3+-DPA),在波长545nm处有强长效荧光。 4.芽胞对单纯的H_2O_2溶液有明显的抗力,经浓度为1.00mol的H_2O_2溶液作用60min时只能达到0.084个对数级的杀灭效果。但发芽体抗力明显下降,相同浓度和作用时间杀灭数量达到1.229个对数级。 5.在羟自由基(·OH)反应体系中, H_2O_2/Fe~(2+)浓度、比例、pH、作用时间、反应温度等是重要的杀灭发芽体的影响因素,其中,H_2O_2/Fe~(2+)9:1,酸性pH环境,30℃以上作用温度,30min以上作用时间有高滴度的杀灭效果。 6.以发芽处理→碱性溶液协同处理→酸性溶液中和→羟自由基氧化的联合作用程序可使类炭疽芽胞的灭活达到5.020个对数级;电镜下核膜结构模糊,核心溶解,大多数菌体已成空壳,芽胞菌体壳质断裂破损,少部分可见皮质区向核区崩解;对模拟环境(石头、瓦片、土壤、布片、木块、水、植物叶片)中的芽胞杀灭率达到99.81-100%;其作用液进行小鼠急性经口毒性试验初步结果为无毒。


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