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《第三军医大学》 2011年
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复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂对大鼠生殖毒性研究

董正谋  
【摘要】:背景和目的: 牙周病是一种病因复杂的微生物感染性疾病,在世界范围内均有较高发生率。不仅影响咀嚼功能,而且还与许多疾病密切相关,严重危害人类心身健康。抗菌药物是牙周病治疗的手段之一,在牙周病治疗中占有重要地位。相比于传统药物治疗,牙周局部抗菌缓控释制剂具有一些不可比拟的优点,为牙周病治疗开辟了一种全新的给药途径。 复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂是牙周局部抗菌缓控释制剂的应用代表之一,其前期实验已取得较满意效果。为了进一步临床研究和开发应用,本研究对该制剂进行动物生育力与早期胚胎发育毒性试验,以观察动物的配子发育、交配、受精与着床等情况,同时探讨其毒性作用机制。 材料和方法: 1.雌、雄SD大鼠各100只,体重(200±20) g,采用随机数字表法分为阴性对照、低、中、高剂量组和干预组,各每组20只分笼喂养;低、中、高剂量组每日按体质量灌服复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂(1 g/kg、4 g/kg、8 g/kg),阴性对照组灌服双蒸水,雄鼠连续给药42 d至交配成功,雌鼠为交配前2 w至妊娠第7 d连续给药;干预组按体质量腹腔注射CP(40 mg/kg),连续5 d;雄鼠交配成功后处死,雌鼠妊娠第15 d处死。 2.管理期间每日观察大鼠外观、行动、饮水和死亡等情况;处死后大体解剖,对比观察主要脏器,如心、肺、肾、肝、脾脏等,记录异常情况。 3.雄鼠每周记录体质量变化,雌鼠交配前每周、交配后每5 d记录体质量变化。 4.雌雄大鼠按1:1交配,记录交配成功时间,观察生育力、受孕力;睾丸、附睾、卵巢和子宫称其质量并计算其系数。 5.取附睾组织于生理盐水中制成精子悬液,37℃孵育15 min,室温(26℃)下10 min内完成精子活动度分级和计数:精子悬液甲醇固定,伊红染色后,镜下观察畸形精子,包括香蕉形、胖头、双头、无沟、尾折迭、双尾、无定形,计算畸形率。 6.暴露两侧卵巢及子宫,用放大镜检查黄体数;沿子宫角背侧纵行切开,暴露植入体,检查着床数、活胎数、死胎数和吸收胎数,计算着床前死亡率和着床后死亡率。 7.取睾丸、附睾、卵巢和子宫组织,10%中性甲醛固定,脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,苏木精-伊红染色,光镜观察形态学变化。 8.大鼠处死前腹主动脉取血,离心,取上清,用酶联免疫分析试剂盒测定血清T、E2。 9.石蜡切片脱蜡至水,灭活内源性酶,抗原热修复,滴加封闭液,加一抗过夜,加二抗,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片,显微镜观察睾丸、卵巢组织PCNA、Bax表达,进行半定量分析。 10.取出睾丸,以锐利薄刀片快速将其切割成1 mm3大小,置于4℃、2.5%戊二醛固定液中浸泡固定,常规制作透射电镜标本,电镜下观察睾丸超微结构。 11.准确称量睾丸,加一定体积生理盐水,冰浴下研磨6 min制成匀浆,低温(4℃)下2 000 r/min离心15 min,取上清,按试剂盒方法测定蛋白含量、MDA含量和SOD活力。 12.一步法提取睾丸组织总RNA,将总RNA、ABP、Inhibin-a引物和PCR试剂等混匀后放入PCR仪中反应扩增,获得目的DNA片段,取5μLDNA片段与1μL加样缓冲液混匀,加至凝胶中电泳,凝胶成像系统下成像,扫描目标DNA片段灰度,进行ABP、Inhibin-a基因半定量分析。 结果: 1.大鼠一般情况较好,雄鼠在第2 w、3 w、4 w时干预组、高剂量组、阴性对照组各死亡1只;雌鼠在第2 w低剂量组、干预组各死亡1只,妊娠第5 d时阴性对照组、高剂量组各死亡1只;大体解剖对比观察主要脏器无异常。 2.雄鼠从第4 w起高剂量组体质量减轻,雌鼠从妊娠第5 d起高剂量组体质量减轻,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)。 3.各组大鼠交配成功时相差不大,成功率达95%以上,生育率、受孕率均达94%以上,组间比较无统计学意义(P0.05);高剂量组睾丸、附睾、卵巢系数减小,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)。 4.高剂量组A、B级精子减少,C、D级精子增加,精子数量减少,香蕉形、胖头、双头、无钩、尾折迭、双尾和无定形精子均有不同程度增加,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)。 5.大鼠早期胚胎发育检查黄体数、着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数、着床前死亡率和着床后死亡率组间比较均无统计学差异(P0.05)。 6.组织病理学观察高剂量组睾丸生精上皮变薄,细胞排列紊乱,间隙增大;输出小管、附睾管上皮明显变薄,细胞减少,管间疏松;卵巢卵泡数量减少,黄体细胞排列疏松。 7.血清T、E2结果雄鼠高剂量组T、E2降低,中剂量组E2下降;雌鼠高剂量组T、E2降低,中剂量组T下降,与阴性对照组比较均有统计学差异(P0.05)。 8.睾丸、卵巢在高剂量组PCNA表达减弱、Bax表达增强,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)。 9.透射电镜见高剂量组生精上皮排列紊乱,细胞间隙增大;支持细胞线粒体肿胀,滑面内质网数目减少;间质细胞体积减小,质膜皱缩,内质网稀疏,异染色质明显,溶酶体增多。 10.高剂量组Mn-SOD、CuZn-SOD活力降低,MDA含量升高;中剂量组CuZn-SOD降低,与阴性对照组比较均有统计学差异( P0.05)。 11.睾丸ABP、Inhibin-a基因表达高剂量组ABP和inhibin-a基因表达量降低,与阴性对照组比较有统计学差异(P0.05)。 结论: 1.复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星牙周缓释制剂在其临床设计剂量范围内对动物的生育力和早期胚胎发育无毒性作用。 2.高剂量制剂可引起雄鼠体质量减轻,睾丸、附睾系数减小,精子活动能力降低、计数减少、畸形率增加,睾丸和附睾发生形态学改变;血清T、E2降低,睾丸PCNA表达减弱、Bax表达增强、SOD活力降低、MDA含量升高和ABP、inhibin-a表达量降低可能是其毒性作用机制之一。 3.高剂量制剂可引起雌鼠体质量减轻,卵巢系数减小和形态学改变;血清T、E2降低,卵巢PCNA表达减弱、Bax表达增强可能是其毒性作用机制之一。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R965

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