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《第三军医大学》 2011年
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HIF-1α在IFN-γ及TNF-α协同引起肠上皮屏障功能损害中的作用

刘行  
【摘要】:一、背景与目的 肠上皮屏障功能损害是严重烧伤早期病理生理变化的重要机制之一。严重烧伤后受应激、缺血缺氧、炎症反应等的影响,全身肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)等炎症细胞因子释放急剧增加,同时肠道局部组织也产生大量细胞因子。这些细胞因子与烧伤后发生的肠道屏障功能损害有什么关系,它们是否参与烧伤后肠道屏障功能损害的发生,如果参与,其分子机制又是什么,目前的研究资料尚不能完全回答这些问题。 过去的研究表明,IFN-γ、TNF-α、IL-1β等细胞因子可以单独或协同引起肠上皮屏障功能损害,细胞因子可通过诱导肠上皮细胞肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)蛋白表达,引起肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)磷酸化水平增加,导致细胞紧密连接(tight junction, TJ)相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-1改变,从而损害肠上皮屏障功能。但是,细胞因子诱导肠上皮细胞MLCK蛋白表达增加的分子机制还不完全清楚。 缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是调节机体对缺氧适应性反应的重要核转录因子,由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成。HIF-1α亚基由氧浓度调节表达,HIF-1β亚基则持续表达。近年的研究发现,HIF-1α在免疫应答及炎症反应的调控中也具有重要作用。氧浓度并非是调节HIF-1α的唯一因素,在常氧条件下炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等对HIF-1α的蛋白积聚、DNA结合活性及其靶基因的表达均有重要调节作用。因此,我们假设:作为一种既参与缺氧适应性调控反应又在炎症反应调控中起重要作用的核转录因子,HIF-1α有可能通过调控肠上皮细胞MLCK蛋白表达,从而参与IFN-γ及TNF-α协同引起的肠上皮屏障功能损害。本课题利用体外单层肠上皮细胞模型,研究HIF-1α是否通过诱导肠上皮细胞MLCK蛋白表达而参与了IFN-γ及TNF-α协同引起的肠上皮细胞屏障功能损害,以进一步阐明严重烧伤后肠上皮屏障功能损害的分子机制。 二、方法 1.以体外培养的人肠上皮细胞株Caco-2单层为研究对象,用IFN-γ(10ng/mL)或/与TNF-α(10ng/mL)处理肠上皮细胞单层。用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)荧光示踪法检测肠上皮细胞单层的通透性,电阻测定仪检测跨肠上皮细胞单层电阻(TER),免疫荧光法检测TJ蛋白ZO-1及occludin分布形态的变化,用蛋白质免疫印迹法检测HIF-1α、ZO-1、occludin、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化的变化。 2.研究分别应用HIF-1α抑制剂寡霉素(40μg/mL)及YC-1(400μmol/L)抑制HIF-1α蛋白表达对IFN-γ与TNF-α处理引起的肠上皮细胞单层通透性、TER、TJ蛋白分布形态、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化的影响。 3.研究采用RNA干扰技术沉默HIF-1α基因对IFN-γ与TNF-α处理引起的肠上皮细胞单层通透性、TER、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化的影响。 三、主要结果 1.IFN-γ或TNF-α单独作用对肠上皮细胞单层TER、TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形态、HIF-1α蛋白表达、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化无明显影响;而IFN-γ及TNF-α协同作用则引起肠上皮细胞单层通透性明显增加,TER显著降低,TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形态不规则,而且occludin在细胞浆内分布明显增加,即发生重新分布,HIF-1α蛋白表达、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化明显增加;但是,IFN-γ或TNF-α无论单独还是协同作用,对肠上皮细胞单层TJ蛋白occludin的蛋白表达含量均无明显影响。 2.HIF-1α抑制剂寡霉素能减轻IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害,表现在寡霉素能改善IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮细胞单层通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形态改变。同时,寡霉素能明显抑制IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮细胞单层HIF-1α蛋白表达、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化水平增加。 3.HIF-1α抑制剂YC-1也能减轻IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害,表现在YC-1能改善IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮细胞单层通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形态改变。同时,YC-1能明显抑制IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮细胞单层HIF-1α蛋白表达、MLCK蛋白表达以及MLC磷酸化水平增加。 4.采用RNA干扰明显抑制肠上皮细胞HIF-1α表达后,IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害包括肠上皮细胞单层通透性增加及TER降低均得到明显减轻,同时IFN-γ及TNF-α协同作用引起的肠上皮细胞单层MLCK蛋白表达及MLC磷酸化水平增加基本恢复至正常。 四、结论 1.IFN-γ与TNF-α协同作用引起肠上皮屏障功能损害、TJ蛋白ZO-1及occludin形态发生改变尤其是occludin重分布、MLCK蛋白表达增加以及MLC磷酸化水平增加,同时伴有HIF-1α蛋白表达增加。HIF-1α可能是IFN-γ与TNF-α协同引起肠上皮屏障功能损害的重要介质。 2.HIF-1α抑制剂寡霉素及YC-1均能减轻IFN-γ与TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害、TJ蛋白ZO-1及occludin形态发生改变、MLCK蛋白表达增加以及MLC磷酸化水平增加。HIF-1α参与了IFN-γ与TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害的发生。 3.沉默HIF-1α基因能减轻IFN-γ与TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害、MLCK蛋白表达增加以及MLC磷酸化水平增加。HIF-1α通过诱导MLCK蛋白表达增加所介导的MLC磷酸化而参与了IFN-γ与TNF-α协同作用引起的肠上皮屏障功能损害的发生。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R644

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