过表达ANT1基因诱导血管平滑肌细胞凋亡与Bax/Bcl-2表达的关系研究
【摘要】：研究背景及目的:
冠心病介入术后再狭窄发病率高,成为介入手术晚期失败的主要原因。再狭窄的发生主要原因是新生内膜形成和血管重塑,其中平滑肌细胞凋亡与增殖的失衡在新生内膜形成中发挥关键作用[1]。参与平滑肌细胞凋亡的调节因子众多,调节机制也存在多条途径。主要有线粒体介导的信号通路,死亡受体介导的信号通路等。线粒体是细胞能量代谢的中心,并且在细胞凋亡过程中发挥重要的调节作用。在细胞接受凋亡刺激后,引起线粒体膜通透性增高,线粒体膜电位降低,继而释放凋亡相关蛋白,如细胞色素C(CytC)、凋亡诱导因子(AIF)等,释放的CytC与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)结合,活化半胱氨酸蛋白水解酶(caspase) 9,进而激活caspase 3途径,从而导致细胞凋亡。
腺嘌呤核苷酸转位酶是定位于线粒体内膜的转运蛋白之一,属于物种进化中的保守区域,是细胞凋亡调节的关键基因[2],研究表明ANT1诱导凋亡作用与线粒体渗透性转换复合孔(mitochondrial permeability transition pore MPTP)有关[3],可能作为MPTP的一个必要成分,或是与MPTP的主要成分之一-----亲环素D( Cyclophilin D)相互作用[4],从而引起线粒体膜电位降低,触发线粒体途径的细胞凋亡。细胞实验证实ANT1可以诱导心肌细胞及肿瘤细胞的凋亡,在体实验中可以减小肿瘤瘤体体积[5,6]。
因而,本研究通过构建ANT1腺病毒载体,分别用携带ANT1基因的GFP标记的腺病毒及空载体腺病毒转染体外培养的血管平滑肌细胞,检测ANT1的表达,进而对过表达ANT1的平滑肌细胞进行凋亡检测及增殖活性检测,并分别提取各组细胞的mRNA和蛋白,检测其中Bax/Bcl-2的表达。从而评价其对平滑肌细胞凋亡的诱导作用及作用机制,以此为作用靶点,可能为支架术后再狭窄等有关平滑肌细胞增殖与凋亡失衡疾病提供了新的治疗途径。
实验方法:
1、构建携带ANT1基因的GFP标记的重组腺病毒表达载体。采用分子克隆技术,重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-ANT1和pShuttle-GFP-CMV,与pAdxsi载体酶切后连接,采用脂质体转染法转染人胚肾HEK293细胞,包装产生ANT1腺病毒颗粒,RT-PCR鉴定为ANT1重组复制缺陷腺病毒后进行大量扩增。
2、组织块法体外培养原代大鼠血管平滑肌细胞,用α-actin进行鉴定。以Ad-ANT1或Ad-GFP病毒转染VSMCs,观察不同时间的转染效率。并通过RT-PCR及Western Blotting方法检测各组细胞ANT1mRNA及蛋白的表达水平。
3、以Ad-ANT1或Ad-GFP病毒转染VSMCs,分别检测细胞凋亡和细胞增殖:利用激光共聚焦观察Hochest染色凋亡细胞核,流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率,激光共聚焦观察TMRE法检测线粒体膜电位改变。细胞计数法及CCK8法检测细胞的增殖活性。
4、转染后分别取各组细胞,利用RT-PCR及Western Blotting方法检测各组Bax/Bcl-2的mRNA及蛋白的表达水平。
结果:
1、经细胞形态学和α-actin免疫细胞化学方法鉴定,应用组织块法原代培养所得细胞即为VSMCs。可以用于后续实验。
2、成功构建并扩增了Ad-ANT1和Ad-GFP(空载体对照)腺病毒,病毒滴度测定为2×1011pfu/ml。最佳感染复数MOI为80-100,分别用ANT1腺病毒载体及空载体腺病毒转染VSMCs后,转染效率高约80-90%,RT-PCR及Western Blotting显示于空载体转染组相比较,前者ANT1mRNA及蛋白的表达水平均显著增高。可以用于后续实验。
3、细胞凋亡检测结果:形态学检测:激光共聚焦观察Hoechst染色后,Ad-ANT1转染组细胞染色质边聚,细胞核不规则,固缩,或碎裂等明显细胞凋亡表现。空载体组细胞核无显著性改变。TMRE法检测细胞线粒体膜电位,Ad-ANT1转染组细胞出现线粒体膜电位下降或消失,空载体转染组无显著性改变。TUNEL及流式细胞术显示Ad-ANT1转染组细胞凋亡特征明显,然后计数凋亡细胞,与空载体转染组相比较有显著性差异。
4、细胞增殖活性检测结果:经细胞计数及CCK8法检测,与空载体转染组相比较,Ad-ANT1转染组细胞增殖活性显著降低。
5、RT-PCR及Western Blotting检测Ad-ANT1转染组Bax的mRNA及蛋白表达水平增高,与空载体转染组相比较有显著差异。Bcl-2 mRNA及蛋白的表达水平两组间无显著差异。
结论:
1、成功构建了ANT1的腺病毒过表达载体,并且在体外培养的血管平滑肌细胞中有效表达。
2、过表达ANT1腺病毒组能明显抑制细胞增殖活性,诱导血管平滑肌细胞出现凋亡。
3、过表达ANT1腺病毒载体,诱导血管平滑肌细胞凋亡的可能机制,是通过上调Bax从而使Bax/Bcl-2升高而实现的。
【关键词】：腺嘌呤核苷酸转位酶1 重组腺病毒 血管平滑肌细胞 线粒体膜电位 凋亡 【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R541.4
【目录】：
- 英文缩写一览表4-6
- 英文摘要6-10
- 中文摘要10-13
- 前言13-15
- 第一部分 ANT1 基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达15-35
- 材料与方法15-28
- 结果28-33
- 讨论33-34
- 小结34-35
- 第二部分 ANT1 诱导大鼠血管平滑肌细胞的凋亡并抑制细胞增殖及其作用机制35-50
- 材料与方法35-40
- 结果40-48
- 讨论48-49
- 小结49-50
- 全文结论50-51
- 致谢51-52
- 参考文献52-54
- 文献综述腺嘌呤核苷酸转位酶与细胞凋亡54-60
- 参考文献58-60
- 研究生期间发表的文章60
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杨雪超;樊明文;;人骨形成蛋白7荧光真核表达载体的构建及体外生物学活性检测[J];中华口腔医学杂志;2006年04期 |
| 2 |
林观平;熊亮;李树梅;黄金文;周克元;;PTEN磷酸酶活性对乳腺癌细胞ZR-75-1迁移能力的影响[J];肿瘤;2007年10期 |
| 3 |
段艳;王冰;崔韶辉;赵不凋;姜云霞;杨颖;姜慧明;张树彪;;阳离子脂质体转染Hela细胞的实验[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年11期 |
| 4 |
雷炳喜;赵义营;牛江涛;邓跃飞;;pEGFP-ING4真核表达载体的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达[J];中国微侵袭神经外科杂志;2011年01期 |
| 5 |
徐海燕,於葛华,刘琳,郑路,李文香,施勤,邱玉华,张学光;人Blys转染细胞对B细胞功能的影响[J];现代免疫学;2005年02期 |
| 6 |
安英华;孙树汉;张治;朱彦琪;张建军;;血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验[J];中国临床康复;2006年41期 |
| 7 |
刘官智;伍津津;朱堂友;鲁元刚;杨亚东;杨桂红;;外源性人端粒酶逆转录酶基因转染对正常人毛乳头细胞的影响[J];第三军医大学学报;2008年03期 |
| 8 |
王兴旺;药物敏感基因与肿瘤的化学治疗[J];中国肿瘤临床;1996年09期 |
| 9 |
陈伟红,丁劲,宫卫东,聂青和,王九平,周永兴;内源性TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的诱导作用[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年05期 |
| 10 |
梅旭;刘政;邱广斌;;MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定[J];中国实验诊断学;2010年08期 |
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