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《第三军医大学》 2010年
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靶向微泡介导兔易损斑块新生血管超声分子显像及CXCR4在AS演进中的研究

刘宏  
【摘要】:背景和目的: 1动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是影响人类健康的主要疾病,绝大多数患者在没有任何前驱症状情况,死于急性心血管事件。近年来研究发现,导致急性心血管病事件的主要原因是动脉粥样硬化斑块破裂和动脉血栓形成,而这主要取决于斑块的易损性(vulnerability),易损斑块(vulnerable plaque ,VP)及不稳定斑块破裂是导致急性冠状动脉综合征重要因素之一。除目前国际公认的易损斑块诊断指标:脂质池体积、炎性细胞浸润数量及纤维帽厚度之外,斑块新生血管密度及分布亦是衡量斑块易损性和稳定性的一项重要指标。新生血管是动脉粥样硬化斑块一个重要病理学特征,也是动脉粥样硬化发生发展的重要危险因素。靶向超声对比显像技术是分子水平显影成像技术之一,利用超声造影剂(微泡)表面固有的生物学特性,或者通过对微泡表面连接特异性的抗体或配体,构建具有靶向能力超声微泡造影剂,经静脉注入体内后靶向性聚集于靶目标,对于临床诊断、治疗疗效以及药物开发等诸多方面均有重要意义。因此,通过具有靶向能力的影像学技术检测斑块内新生血管,在辨识斑块稳定性,预防心脑血管事件的发生等方面具有重要作用。 血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)作为重要的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)的主要受体,VEGFR-2高表达于易损斑块新生血管的内皮细胞。VEGF主要通过两个络氨酸激酶受体发挥作用:VEGF receptor-1(Flt-1)和VEGF receptor-2(KDR/Flk-1),VEGFR-2具有促进血管内皮细胞增殖、迁移,增加血管通透性等作用。本实验应用生物素-亲和素-生物素桥连方法制备携VEGFR-2单抗靶向微泡造影剂,利用高频超声对比造影技术无创性动态观测活体兔腹主动脉易损斑块新生血管的增强显影效果,斑块显影强度与相应的斑块VEGFR-2免疫组织化学染色量化结果进行相关性分析,并与血脂水平和病理学检查相结合,初步探讨一种检测易损斑块新生血管靶向增强显影的超声分子成像技术。 有研究证实了斑块内血管生成在动脉粥样硬化形成与发展中具有重要作用,动脉粥样硬化中的新生血管大部分为不成熟,周细胞和平滑肌细胞数量缺乏,其通透性较大,有利于炎症细胞渗透进入斑块内部,促进炎症反应发生,增加斑块不稳定性与易损性。因此,深入研究和理解动脉粥样硬化血管生成的过程及其调控机理,对于促进抗血管生成治疗粥样斑块,增加斑块稳定性都具有重要意义。趋化因子是一类超家族的细胞因子,由于基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor 1α,SDF-1α)靠近N端的2个半胱氨酸被一个其他的氨基酸隔开而被归为CXC亚家族。它的唯一受体是趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4),CXCR4在单核细胞、淋巴细胞、平滑肌中均有表达,它们都是与动脉粥样硬化形成过程相关的主要细胞成分。有研究发现CXCR4能促进肿瘤组织转移及血管形成,但它在动脉粥样硬化血管生成中的研究鲜有报道。本研究通过建立动脉粥样硬化模型,检测不同时间点趋化因子受体CXCR4与血管内皮生长因子VEGF表达变化及其相关性,初步探讨趋化因子受体CXCR4在动脉粥样硬化斑块血管生成中的作用及可能机制。 方法: 1.短肽GL-7靶向微泡造影剂对高脂饮食兔腹主动脉内膜体外特异性结合及体内增强显影效果: 高脂饮食法建立兔腹主动脉内膜损伤模型后随机分为两组:分别使用靶向和非靶向微泡造影剂行腹主动脉超声造影观察。视频密度法评价两种造影剂对动脉内膜增强显影效果。免疫荧光染色观察两种造影剂与动脉内膜特异性结合及荧光染色强度差异。 2. VEGFR-2靶向微泡造影剂介导兔腹主动脉易损斑块新生血管超声分子显像:采用球囊损伤血管内皮+高脂饲料喂养+p53腺病毒转染的方法,模拟人类易损斑块病理学特点,建立兔腹主动脉易损斑块模型,利用高频超声对比造影技术无创性动态观测活体兔腹主动脉易损斑块新生血管增强显影效果,斑块显影强度与相应的斑块VEGFR-2免疫组织化学结果进行相关性分析,并与血脂水平和病理学检查相结合。 3.兔动脉血管中趋化因子受体CXCR4与血管内皮生长因子VEGF表达变化及其相关性: 新西兰大白兔高脂饲料喂养+球囊拉伤腹主动脉法建立动脉粥样硬化模型,分别于第4、8、12周末处死动物,截取腹主动脉血管,蛋白质印迹Western Blot法检测CXCR4蛋白含量变化。荧光定量PCR法检测VEGFmRNA表达变化,结果进行相关性统计学分析。免疫组织化学染色法检测动脉粥样硬化斑块CXCR4、CD34表达与定位。 结果: 1.靶向、非靶向微泡造影剂造影后血管内膜回声均较造影前增强,靶向造影组较非靶向造影组血管内膜峰值视频强度比较,差异有统计学意义(137. 49±13. 56 dB vs 111. 24±15. 23 dB; P 0.05)。荧光显微镜下观察,靶向微泡造影组与动脉内膜特异性结合呈明亮绿色荧光表达,而非靶向造影组内膜面呈微弱绿色荧光,两组荧光强度比较有统计学差异(76.74±13.64 vs31.17±14.81; P 0.05)。 2.生物素-亲和素法成功制备VEGFR-2靶向微泡造影剂。建立兔腹主动脉易损斑块模型具有人类易损斑块基本病理学特点。12周末,靶向微泡造影组视频强度与对照组比较差异有统计学意义(144. 42±17. 70 dB vs 106. 88±9. 38dB; Z= -3.984, P=0.000)。靶向VEGFR-2微泡造影组动脉斑块视频强度与相应VEGFR-2免疫组织化学阳性表达呈显著正相关,Pearson相关系数(r 2 = 0.78, P=0.001),而与此相反在对照组,Pearson相关分析结果表明与相应VEGFR-2表达水平之间无相关关系,Pearson相关系数((r 2 = 0.17, P=0.301)。 3.兔动脉粥样硬化模型第4、8、12周3个时相点动脉血管CXCR4蛋白含量分别为:(0.46±0.03)、(0.58±0.05)、(0.65±0.07);动脉血管VEGF mRNA表达为(1.04±0.24)、(1.99±0.21)、(3.97±0.75),两者之间呈显著正相关(Pearson相关系数r2= 0.869,P 0. 05)。免疫组织化学CXCR4染色在血管内膜及斑块内部可见多处阳性染色,CD34阳性染色于血管内皮细胞,动脉斑块内可见丰富的新生血管,棕黄色阳性表达。 结论: 1.短肽GL-7靶向微泡造影剂与兔动脉血管内膜体内、体外特异性结合,并可显著增强高脂饮食兔腹主动脉内膜靶向增强显影。 2. VEGFR-2靶向超声对比分子显像的方法对观察兔易损斑块新生血管表达具有良好的相关性与特异性,为采用靶向超声分子显像的方法在体无创性评估兔易损斑块新生血管奠定了初步的实验基础。 3.兔腹主动脉粥样硬化进程中,趋化因子受体CXCR4和血管内皮生长VEGF表达含量呈正相关,趋化因子受体CXCR4可能在斑块血管生成中具有重要作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R543.5

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