氢气促糖尿病创面愈合的研究

【摘要】：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种慢性代谢障碍性疾病。糖尿病皮肤创面难愈性是最常见的糖尿病慢性并发症,其中以糖尿病足为代表,许多患者因此截肢致残。而高血糖为何造成皮肤易受损,从而发展成难愈性创面,许多研究提供了各种学说,目前认为高血糖时氧化应激(Oxidative Stress,OS)是重要的共同机制。 OS可产生大量的自由基,而羟自由基(?OH)和过氧化亚硝酸阴离子(ONOO-)具有强氧化性,能和具有重要功能的生物大分子(如DNA、蛋白质、脂类)发生反应,破坏其功能及结构。因此抗自由基治疗是减少OS造成损害的重要措施。传统的维生素C等抗氧化剂只能非特异性的清除自由基,在发挥保护作用的同时又清除了有益的自由基。寻找特异性自由基清除剂治疗糖尿病创面可能更为有效。以往也有特异性抗氧化剂应用于临床治疗的例子,如依达拉奉(必存),可特异性的清除?OH,主要用于改善急性脑梗塞所致的神经症状,效果较显著,但药物的不良反应较多。 氢气(H_2)是自然界最简单的气体分子,以往被人们认为是一种惰性气体(生物学范畴),在生物体中没有任何作用。近期有研究证明,吸入H_2或口服富氢水在心、脑和肝缺血再灌注损伤后有保护作用,在体外无细胞化学系统中H_2可以特异性的中和?OH及ONOO- ,减少OS。H_2作为一种新发现的选择性抗自由基物质,可能尤适合于氧化应激明显的糖尿病创面的治疗。为此,深入认识H_2在糖尿病创面愈合过程中的作用及其机制,将可能为临床治疗开辟一种新的方法,有着重要的意义。 在糖尿病创面中,炎症反应持续存在,不利于其愈合。OS导致的炎性细胞持续浸润产生的大量自由基可介导炎性损伤,而且OS可激活核因子-κB(NF-κB),生成大量的炎症因子,损伤细胞,干扰创面的愈合。H_2被证明在小肠移植中可显著减少炎症因子IL-6、IL-1β等,降低炎症反应导致的小肠移植损伤。H_2在糖尿病创面中是否也能抑制局部持久过度的炎性反应值得研究。 丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路与细胞增殖、凋亡等密切相关,包括几种通路途径:细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、P38。在糖尿病创面中,OS可激活MAPK,影响成纤维细胞等的生物学行为,不利于组织再生;P38可以增加血管渗透性,造成组织的充血、水肿,也不利于创伤的愈合;以往的研究证明ERK、JNK和P38的激活很可能是糖尿病外周神经通路传导异常的发病机制之一。H_2具有中和自由基,减轻OS的作用,有可能在糖尿病创面愈合中最终影响MAPK的激活而发挥保护作用。 基于以上资料,本研究拟达成以下目的:(1)采用糖尿病小鼠创面模型,应用腹腔注射富H_2生理盐水的方法,从形态学和组织学方面观察H_2对创面愈合的作用,同时检测对氧化指标的影响;(2)体外分离培养人正常皮肤成纤维细胞,用高糖造成细胞氧化应激,采用富氢培养基处理细胞,了解H_2是否能保护高糖造成的成纤维细胞氧化损伤,对细胞氧化产物和抗氧化系统的影响,以及对MAPK和NF-κB通路的作用。方法:采用链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠模型,用打孔器建立全层皮肤缺损的圆形创面模型。制备富氢生理盐水,给小鼠腹腔注射,然后在各时相点切取愈合创面组织,做HE和Masson染色、固定组织行电镜超微观察及进行免疫组织化学染色检测创面中转化生长因子-β1(TGF-β1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、NF-κB变化,采用激光共聚焦显微镜观察小鼠皮肤内超氧阴离子(O2-),检测氧化产物丙二醛(MDA)水平。同时,体外分离培养人皮肤成纤维细胞,应用富氢培养基处理高糖培养的细胞,观察细胞生长状态,采用cck-8试剂盒检测细胞增殖,JC-1染色检测细胞线粒体膜电位变化,测定细胞内O2-、氧化产物MDA、8-OHdG和抗氧化系统超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)水平,采用Western Blotting法测定细胞内MAPK、NF-κB及TGF-β1表达情况。 结果: 1、成功建立延迟愈合的糖尿病小鼠创面模型; 2、应用氢盐水腹腔注射后,跟踪观察发现糖尿病小鼠创面愈合过程明显好转,且愈合时间缩短; 3、切取创面组织,进行HE和Masson染色可见,氢盐水腹腔注射可减少糖尿病小鼠创面炎性细胞浸润时间,促使肉芽组织、成纤维细胞和微血管生成,胶原生成增多; 4、电镜发现,糖尿病小鼠创面组织中可见许多炎性细胞,成纤维细胞较少且状态差,H_2可促使成纤维细胞的大量增殖,细胞状态旺盛,胞核大,粗面内质网扩张,线粒体多; 5、采用免疫组织化学染色可见,氢盐水腹腔注射可增加创面愈合过程中TGF-β1、PCNA表达,降低NF-κB水平; 6、H_2可显著减少糖尿病小鼠皮肤O2-及血清中MDA水平; 7、富氢培养基可以改善高糖处理后人皮肤成纤维细胞的生存状态,降低高糖对细胞增殖的抑制作用; 8、激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位水平,发现富氢培养基能改善高糖处理后细胞线粒体膜电位的降低; 9、采用富氢培养基后,高糖处理细胞的氧化产物MDA、8-OHdG明显减少,而抗氧化系统SOD、GSH水平提高; 10、高糖处理后成纤维细胞的TGF-β1表达降低,MAPK、NF-κB被激活,而富氢培养基可以降低这一影响。 结论: 1、氢盐水腹腔注射可有效促进糖尿病小鼠创面的愈合,改善成纤维细胞的生物学行为,促进胶原的生成; 2、H_2可降低糖尿病小鼠氧自由基及氧化产物水平,减轻了过度的炎症反应,促进创面肉芽组织的增殖,成纤维细胞状态旺盛,增加创面中TGF-β1、PCNA水平,降低NF-κB的过度激活; 3、H_2可以减轻高糖对人正常皮肤成纤维细胞的氧化损伤,提高细胞抗氧化系统能力,保护细胞线粒体膜电位,SOD水平的提高可能是H_2减少高糖造成的高O2-水平的一个原因; 4、H_2促糖尿病创面愈合、保护高糖造成的成纤维细胞氧化损伤,可能与降低MAPK、NF-κB的激活有关。

【关键词】：糖尿病 氢气 超氧阴离子 超氧化物歧化酶 丝裂原激活的蛋白激酶 创伤难愈 氧化应激
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R587.2;R641
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