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《第三军医大学》 2001年
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腺病毒介导AT2R转基因对血管平滑肌细胞生物学行为影响的研究

刘建平  
【摘要】: 研究背景和目的:血管损伤后再狭窄(RS)是一个复杂的过程,新生内 膜形成是其主要病理基础,新生内膜的主要成因是血管平滑肌细胞(VSMC) 表型发生改变,发生增殖及内膜下迁移。在导致或加重VSMC增殖和迁移 诸多因素中,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所介导的生物学作用是其中重要的因 素之一。AngⅡ具有多种生物学作用,其作用的多样性是通过其受体的多样 性介导的,目前已确定的AngⅡ受体至少有两型,即AngⅡ1型受体(AT1R) 和AngⅡ2型受体(AT2R)。人们所熟知的AngⅡ的大多数生物学作用,包 括其促VSMC增殖及内膜下迁移作用,是通过其AT1R所介导的,对AT2R 的作用则了解较少。已有的研究提示,AT2R在对血管张力、细胞增殖、迁 移等方面都有与AT1R相拮抗的作用,但AT2R主要在动物胚胎发育期表达 较强,出生后很快减弱,成年动物仅在脑、卵巢、肾上腺等组织有表达,血 管等组织表达较少或不表达,因而对其抑制VSMC增殖、迁移作用在RS 中的作用认识较少。在被损伤血管的组织中,AT2R表达较少,AngⅡ主要 通过AT1R介导产生促VSMC增殖、迁移的作用,而缺乏AT2R介导的抑 制效应,也许是RS发生发展的一个重要因素,增强AT2R在靶血管中的表 达可能达到抑制RS的目的。基于这一认识,本研究通过构建AT2R基因的 重组腺病毒载体并转染体外培养VSMC,研究其表达及表达后VSMC增殖、 迁移和凋亡等生物学行为所受的影响,从而探讨增强AT2R表达在RS发生 发展中的作用和意义。 研究方法:用组织块贴壁法培养原代大鼠主动脉血管VSMC用作体外 转染表达AT2R的实验平台;用同源重组方法构建携带大鼠AT2R cDNA的 复制缺陷型人类5型腺病毒载体,并用293细胞扩增,纯化制取高滴度腺病 毒载体转染液,并用常规方法转染体外培养VSMC;AT2R转染VSMC后, 弟三军医大等博士企丈 ATZR细胞表达率用流式细胞仪检测,其膜表达、蛋白表达和 mRNA的转录 表达分别用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法和RT干CR法检测;AhR转 染表达后对VSMC增殖力的影响分别用细胞分裂指数、细胞增殖周期、MTh 法和 5-滨脱氧尿昔6ErdU)掺入法检测;ATZR转染表达后对 VSMC迁 移能力的影响用改良Boyden七趋化小室计数迁移细胞数和激光共聚焦显微 镜检测细胞骨架蛋白F七Ctin表达变化的方法检测:ATZR转染表达后对 VSMC凋亡用流式细胞仪。原位末端标记法(TUNEL染色法)、及凋亡基 因比上、bgy mRNA转录表达检测等方法检测;用不同浓度Angll刺激转 染细胞;千预因素选用AT IRfa抗剂(CVngN淖AT ZRfa抗剂PD12刀9人 各组均同时检测 ATIR表达变化,分析ATIR和 ATZR表达的关系。 研究结果八1)采用同源重组构建复制缺陷型腺病毒载体技术,成功构建 了带 ATZR CDNA的人类 5型复制缺陷型腺病毒重组体一AdCMV-ATZR,纯 化制取病毒转染液滴度约SXwi’pf\II:Ill---c经计算其最佳MOI为30;Q)用 组织块贴壁法,本实验成功原代培养了大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并经免 疫组织化学及细胞形态学方法鉴定确认:臼)*扎MV-ATZ R转染*S*C后, 通过流式细胞仪、免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法及RT-PCR方法分别检 测ATZR细胞表达率、膜表达、蛋白及InRNA表达的结果证明VSMC成功 获得ATZR表达,表达率随转染表达时间延长逐渐增加,最高细胞表达率约 89.sl%;N)Angll作用对ATZR转染表达无显著影响,ATZR表达对Angll 也无显著浓度依赖性;(5)ATZR转染表达对 ATIR表达不产生显著影响, 转染表达 ATZR的 VSMC,施加 Angll刺激时 ATIR表达仍明显上调;旧) ATZR表达显著抑制VSMC增殖:与未转染组比较,ATZR峰值表达时,VSMC S期和*-M期比率由3**%降到1)9%…<0刀5X细胞分裂指数山刀.*%降 到9石%…<0刀1),*h和5Erd掺入量的吸光度检测值分别降低61.*%和 引*%…0刀1\()ATZ R表达明显抑制***C迁移。与未转染组比较, AT ZR峰值表达时,*S*C迁移细胞数减少6L%(功刀5),细胞骨架蛋白 F砒扣表达也显著减少八8)A卫以1刺激可增强AT ZR介导的抑制VS*C增 殖和迁移作用,但这一作用也无显著浓度依赖性;(9)ATZR有显著促VSMC ·Vll· 上 二一 腺病毒介导ADR转基因对血管平滑肌细胞生物学行为影响的研究 凋亡的作用:与未转染组比较,转染组AhR表达48小时其细胞凋亡率由 二.6%增加到32.l%(p<0*5),致凋亡的bax mRNA表达增加 76.3%(p<0.of), IU’ru-- L染色也检测到大量*S*C凋亡:门0)AT IR和AT ZR i抗剂均对 AhR在VSMC的转染表达无显著影响,ATIR a抗剂对ATZR所介导的抑 制细胞增殖和迁移的作用无明显影响,而ATZR桔
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R540.2

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【参考文献】
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【共引文献】
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