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《第三军医大学》 2001年
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单羧酸转运蛋白MCT1基因反义表达重组载体转染人肺腺癌细胞及其生物学效应的研究

张桂芝  
【摘要】: 由于肿瘤细胞糖酵解酶系的增强以及同工酶谱的改变,而且肿瘤细 胞生长在一种相对缺氧的环境,因此它们常常通过糖酵解产生ATP。糖酵 解过程中必然产生乳酸,如果要维持细胞内的糖酵解状态,乳酸必须被转 运出细胞外。如果乳酸的外运和生成不能同步,乳酸就会在细胞内堆积, 从而引起细胞内的pH值下降,导致肿瘤细胞内酸化。通常情况下,肿瘤 细胞内乳酸的转运是由一个具有特定组织分布,对底物、抑制剂特异的单 羧酸转运泵家族(MCT)来完成。该家族成员可催化乳酸和H~+同向跨膜转 运,将大量乳酸排出细胞外,所以乳酸能否从肿瘤细胞外流就成为其生存 的关键。如果能选择性地抑制肿瘤细胞的乳酸转运,可能会为肿瘤治疗提 供一个新的策略。 本研究在人肺癌细胞MCT1基因序列同源性分析,MCT1mRNA半定 量分析及MCT1基因反义重组载体构建成功的基础上,通过电穿孔基因转 染方法将MCT1基因反义重组载体转染进入肺腺癌细胞A549中,并对其 生物学效应进行了研究,对MCT基因在肿瘤细胞中的功能作用做了初步 探讨。方法:(1)用电穿孔基因转染方法转染MCT1基因反义重组载体进 人肺腺癌A549细胞,用RT-PCR、PCR方法证实转染的成功。(2)应用荧 光分光光度计、紫外分光光度计测定细胞内pH值、乳酸含量、并通过制 作生长曲线、测定细胞周期、检测原位细胞凋亡,研究转染细胞生物学效 应的变化。(3)用生物发光分析法测定ATP含量的变化,研究转染细胞能 量代谢的变化。(4)用裸鼠移植瘤实验,研究转染细胞的体外增殖情况。 结果:(1)MCT1基因反义重组载体转染、鉴定分析结果:反义基因转染A549 细胞后,经G418筛选,出现阳性克隆;之后用RT-PCR、PCR方法证实 MCTI反义重组载体己经与A549细胞基因组DNA成功整合。(2)细胞内 pH值、乳酸含量、生长性质测定分析结果:转染反义重组载体细胞与未转 染的 A549细胞相比,细胞内 pH值降低…<0刀of入乳酸含量升高(<0刀5卜 生长速度减弱,倍增时间延长O吻刀 1X 细胞周期受到阻滞,细胞凋亡率 增加…功刀 1),差异有显著性。转染空载体细胞也有类似结果,但差异无 显著性O>0.05)。侣)ATP测定分析结果:转染反义重组载体的细胞与未转 染的A549细胞相比,细胞内ATP水平明显下降,差异有显著性O<0刀1> 转染空载体细胞ATP也有相似改变,但差异无显著性O>0刀5)。O)裸鼠 移植瘤实验分析结果:转染反义重组载体细胞较未转染的A549细胞移植 瘤潜伏期长、瘤体小、瘤体重量轻,差异有显著性(叩.001卜结论八IM*TI 反义基因转染后,用RTPCR、PCR方法证实,该载体已经与A549细胞 基因组DNA成功整合。o转染细胞较未转染A549细胞胞内pH值下降, 乳酸升高,生长速度减弱,倍增时间延长,细胞周期受到阻滞,细胞凋亡 率增加。(3)转染细胞较未转染A549细胞胞内ATP含量降低。(4)裸鼠接种 转染细胞与接种未转染细胞后的成瘤情况相比,前者潜伏期长,肿瘤体积 小,瘤体重量轻。这表明 MCT基因在肿瘤细胞的酸碱平衡,乳酸代谢, 生长性质,能量代谢及细胞体外增殖能力方面发挥着重要调节作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R734.2

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