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《第三军医大学》 2001年
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树突状细胞经EB病毒疫苗刺激用于EB病毒感染介导相关肿瘤治疗的研究

王蒙  
【摘要】: EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)是一种人类疱疹病毒,全世界95% 以上的人群在儿童就已感染。它是传染性单核细胞增多症的病因,也与多 种重要的人类癌症相关,如Burkitt's淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)及何 杰金氏淋巴瘤等。在人类,已在上述肿瘤细胞中检出4种EB病毒相关蛋 白,其中EB病毒膜抗原gp340能引起保护性的中和抗体产生、抗体依赖 性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)杀伤作用。因此,gp340作为预防EB病毒原发感染的候选疫苗 受到了广泛重视。 树突状细胞(dendritic cells,DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞,同单 核细胞、巨噬细胞统称为人体的“哨卫系统”(custocyte system)。树突状 细胞能在体内外直接激活初始T淋巴细胞,在激发T淋巴细胞免疫应答 及T淋巴细胞依赖性抗体生成中起重要作用。近来研究表明,应用抗原 或抗原多肽在体外冲击致敏DCs,可有效地诱导抗肿瘤免疫反应。本研 究中我们通过体外实验研究了用GM-CSF+TNF-α+IL-4+IL-3的细胞因子 组合从人骨髓CD34~+造血干/组细胞诱导、分化DCs及鉴定,并进行了DCs 负载EB病毒膜抗原gp340诱导特异性CTLs杀伤EB病毒相关肿瘤细胞 的实验研究。拟为EB病毒相关肿瘤的治疗提供一条新途径。主要结果如 下: 1.采用Mini-MACS分离技术可以从正常人骨髓分离得到高纯度 (>90%)的CD34~+造血干/祖细胞,且回收率(90%左右)和活细胞率(>95%) 均很高,这种方法为进一步获得较纯净DCs提供了保证,符合临床肿瘤 生物治疗时制备大量高纯度DCs的需要,值得推广。 2.经 GM-CSF+TNF-a+IL4的共同诱导培养,可以促进骨髓中 CD34“ 造血干/祖细胞向 DCS分化,在 14天内可以诱导。分化扩增出大量成熟 的 DCS,最终可获得的 DCS为初始干细胞量的 5~10倍,加入 IL-3可进 一步增加 DCS的产量。 3.我们对扩增得到的DCS从三个方面加以鉴定,①形态观察;DCS 形态呈多形性,表面粗糙有不规则突起,胞浆中细胞器丰富,富含线粒体: ②表面标志的检测:*Q高水平表达*D;*③同种异型混合淋巳细胞 反应:DCS可诱导同种异型T淋巴细胞产生明显的增殖反应。因此,根 据 Sornasse D等提出的判别标准,可以认定:我们从人骨髓细胞中诱导 扩增出的细胞是具有良好刺激活性的DCS细胞,而且无菌。无污染,可 用于持续培养,能达到后续实验的要求。 4.我们根据文献报道设计了EB病毒表面膜糖蛋白gp340负载DCS 的方法,结果发现DCs加工处理抗原后激发T淋巴细胞增殖反应的能力 进一步增强,同时也说明通过本方法获得的DCS具有极强的抗原提呈能 力。 5.在进行EB病毒相关性肿瘤细胞的杀伤实验中,只有负载了抗原 gp340的DCS,才能刺激特异性CTLS杀伤EB病毒相关性肿瘤细胞;在 无DCS条件下,仅有T淋巴细胞和抗原gp340,由于缺乏DCS抗原提呈 并刺激T淋巴细胞产生特异性CTLS,故在细胞杀伤试验中T细胞不具有 杀伤肿瘤细胞的能力;同时,DCS如无抗原呈递的对象,其本身是不能 刺激T淋巴细胞产生特异性CTLS的,故在细胞杀伤试验中杀伤肿瘤细胞 的效率极低。 结论与展望: 1.EB病毒膜抗原能够诱导病毒中和抗体的产生,中和 EB病毒感染 和对B细胞的转化活性,还可介导抗体依赖的细胞毒作用及刺激T细胞 产生细胞介导的免疫应答,这一过程中抗原提呈细胞发挥了重要作用。我 们的实验证实了以EB病毒膜抗原gp340为主要成分控制EB病毒感染的 EB病毒疫茵可有效激发兔疫应答,其中DCS提呈膜抗原gp340可能是EB 重庆市院士基金资助项目,项目号:637·Vll· ) 病毒疫苗发挥作用的机理之一,我们的工作从一个方面为EB病毒疫苗接 种策略提供了实验依据,相信在不远的将来以gp340为主要成分的EB病 毒疫苗会进入市场并运用于临床。 2.以控制EB病毒感染的疫苗致敏DCS,能促进抗原提呈并启动抗 肿瘤免疫,体外可有效杀伤EB病毒相关肿瘤细胞,从科学和商业上考虑, 随着EB病毒疫苗的开发上市,DCS疫茵作为一种针对EB病毒相关性肿 瘤的新型治疗性疫苗,将会有着良好的研究价值和开发前景。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R73-36

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【参考文献】
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