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《第三军医大学》 2002年
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腺病毒介导人心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤的修复作用

张正丰  
【摘要】: 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗目标有三个:挽救(rescue)受损神经元的迟发性损伤和死亡;促进神经元轴突的再生(regeneration);组织移植替代(replacement)神经缺损,以求重建损伤脊髓地解剖连接和功能康复。实验性治疗中,组织或细胞移植(胚胎脊髓、神经干细胞、雪旺氏细胞移植等)、神经营养因子运用(BDNF、NGF、NT3等)、再生相关因子基因治疗(GAP43、Bc12等),均直接或间接为受损脊髓提供了抑制脊髓的继发性损伤及促进神经元存活和轴突再生的神经营养因子。神经营养因子通过与靶细胞上受体结合而发挥其生物效应,由于神经元及其受体的差异性,向脊髓损伤区有效地提供特异性神经营养因子非常重要。 心肌营养素-1(cardiotrophin-1 CT-1)是1995年由Pennica等发现的一种细胞因子,与LIF、CNTF、OSM、IL-6、L-11同属于IL-6家族。CT-1能长时间的支持运动神经元、多巴胺神经元和交感神经元的存活,诱导培养交感神经元递质表型的连接。CT-1基因治疗大鼠进行性运动神经元病取得较好的效果。本研究的目的是原核表达huCT-1重组蛋白和构建huCT-1的腺病毒载体,观察SCI后huCT-1能否支持红核神经元的存活、促进红核脊髓束的再生和功能恢复。 主要方法及技术路线: 1.设计与pGEX-2T读框适配的引物,采用PCR及T-A克隆将huCT-1开放阅读框基因克隆到pMD-18T载体上,测序正确后,酶切并回收DNA片段,构建pGEX2T-huCT1。在不同温度不同时间,通过IPTG诱导pGEX2T-huCT1在DH5a大肠杆菌中表达,SDS-PAGE分析表达量和可溶性蛋白比例。GST亲和柱纯化huCT-1融合蛋白,凝血酶酶切融合蛋白并 纯化。坐骨神经切断模型观察重组huCT-l对脊髓前角神经元的存活作用。 2.构建穿梭质粒pDC316-huCTI和 pDC316-eGFP,CsCI梯度离心制 备高纯度的病毒基因组质粒pBHloxdeltal,3Cre、PHG140。培养293细胞, CaCI。法质粒共转染293 细胞构建并筛选腺病毒AdCMV-huCTI 和 AdCMV-eGFP。病毒原液转染293细胞及NIH 3T3细胞,PCR、RT-PCR 及免疫组化鉴定。CSCI梯度离心纯化病毒,空斑试验检测病毒滴度。 3.制备大鼠C3外侧索横切模型,损伤区植入明胶海棉饱和的不同成 分治疗及对照溶液。分为CTl组、AdCMV上 组、空白对照组(单纯 注射缓冲液X AdCMV七GFP对照组及正常对照组。治疗 Iw后观察 AdCMV-huCTI在脊髓中的表达。4W后HE、GFAP、P75染色组织学观察 脊髓损伤区的神经缺损及胶质形成。FG于 CZ注射,Iw、4W、SW时行 脑切片,荧光显微镜观察红核神经元存活。FG于CS注射,4W脑切片, 荧光显微镜下红核神经元记数观察RST再生。BDA于红核注射,脊髓切 片观察红核脊髓束再生。前肢的不对称试验观察行为学的改变。 主要结果及结论: 1.成功构建了hU*l1 的融合表达载体…EX 2*hU*TI,克服了 hllCT-l基因高GC含量对hllCT-l表达量和对载体启动子的影响。通过IPTG 诱导,发现29oC诱导4hr,目的蛋白表达量占全菌的1/5,可溶性蛋白与包 涵体比为2乃。对其进行亲和柱纯化,GST凡此T.1融合蛋白纯度达到“% 以上。融合蛋白酶切后,重组hU*T,1蛋白纯度达到80%以上。 2.发现原核表达重组huCT-1蛋白能挽救55%成年大鼠脊髓运动神经 元的存活,表明原核表达重组hU*l1 蛋白具有生物学活性。同时,说明 hU*T.1对大鼠神经元的作用无种属特异性。 3.采用双质粒共转染293细胞Cre/loxP位点同源重组方法构建了EI 和 E3缺失的含 MCMV启动子才源基因和 SV40 PIOyA的 AdCMV上 和 AdCMV-eGFP载体。经过PCR、RT-PCR和免疫组化证实腺病毒载体构 建成功。病毒经过CSCI梯度离心纯化后,AdCMV-hllCTI 滴度达到 10x10’‘~30x10’‘,适合进行体内直接基因治疗(in viv。)。 ·VI· 4.C3HX损伤后1*周,各组FG标记红核神经元下降不明显。损伤后 8周,AdV-CTI组神经元存活率为89%,损伤组仅为69%。与损伤组相比, 明显支持红核神经元的存活…<0刀5\表明脊髓损伤后,红核神经元存在迟 发性损伤。AdV-CTI在脊髓中长期表达,能支持红核神经元的存活。 5.大鼠C3HX损伤下区注射FG逆行示踪,AdV-CTI组标记的红核神 经元为1.2%,明显多于对照组①.4仰伊<0刀5卜*盯的**AI’厕于示踪,损 伤上、下区BDA标记的神经元也多于对照组,表明CT-1治疗促进RST再 生。CT4治疗组和对照损伤区内胶质癫痕的形成无明显差别,均未见明显 再生的轴突,说明这种再生不是通过损伤区,而是可能通过向未损伤区白 质或灰质再生。CT-1治疗促进RST再生原因可能为CT-1挽救的存活红核 神经元存在或重建了旁支通路和CT-l有较弱促进RST再生的能力。 6.大鼠 C3HX 4周后对照组约 4%的时间使用伤肢,AdV-CTI组约 9% 的时间使用伤肢,明显高于对照组o<0刀5卜 说明AdV-CTI促进SCI功能 的恢复。这种功能恢复可能与CT-1挽救红核神经元存活和RST再生及其 他传导束代偿有关。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R651.2

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