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《第三军医大学》 2002年
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增生性瘢痕的基因芯片分析及意义

王珍祥  
【摘要】: 任何创伤的愈合均伴有不同程度的瘢痕形成,它也常被看成是外科临床的愈合标志,但病变部位胶原的过度沉积或创伤的过度修复,可导致瘢痕的过度增生肥大或异常收缩,结果破坏了人体表面的完整性或伴有不同程度的功能障碍。大量的研究认为,不论在增生活跃还是在成熟稳定的瘢痕组织中,都存在着复杂的细胞活动与物质代谢过程。动物与人,不同个体,不同部位之间,瘢痕形成差别很大。多种刺激或损伤作用于人,导致一系列的细胞和分子事件,这些事件表明机体试图修复皮肤的损伤区域。而参与创面修复的多种细胞因子、细胞外基质分子、蛋白酶都可以调节瘢痕组织中的细胞增殖与迁移、基质的沉积与降解等。虽然经过长期的探索,我们对瘢痕的形成的了解至今仍然十分有限,也缺乏治疗增生挛缩瘢痕的有效非外科手段。 近年来,随着现代细胞生物学和分子生物学的迅猛发展,从细胞和分子水平揭示创伤愈合与瘢痕形成有了较多的成果。瘢痕形成的分子基础涉及细胞外基质与细胞因子、信号转导、细胞周期调控及凋亡等生物学过程,与胶原性疾病、肿瘤的发生存在许多共同点。任何对外部损伤刺激的机体反应,都必然伴随着相关组织内细胞的基因表达变化。因此,在基因转录表达水平全面筛选瘢痕组织中基因表达变化,有可能找到瘢痕组织形成特异相关的基因表达变化;再通过相关基因功能研究,有可能阐明这些特异表达基因与瘢痕组织形成的关系,进而为临床提供新型的治疗手段。 然而,传统分子生物学技术存在较多的局限性,比如Nonhern Blot, 原位杂交等方法仅能对一个或少数几个基因同步分析,而且样本需求多、 耗时长;RT—PCR方法更敏感,基因数可以增加,但也存在限制,对疑难 疾病的分析不能全面深入。 基因芯片技术在有限的载体上加载大量的基因信号,可以用有限的标 本,在短时间内、条件几乎一致的情况下,检测几千上万个基因的表达情 况,从而提供全面可靠的基因表达谱。基因芯片分析在多种正常组织及癌 组织的表达研究中,发现了许多有价值的成果。增生挛缩的癫痕组织是一 种以失控性增生与修复为特征的疾病,类似于良性肿瘤的病变过程,理应 存在或多或少的基因变化。我们需要知道的是,那些基因出现了显著差别, 差别基因又是如何调节疲痕的形成。利用芯片技术对增生挛缩的瘫痪组织 一 与同体正常皮肤进行差异表达分析,可以发现瘀痕中活跃的基因表达谱, 找出参与调控的基因群。 本实验中采用4096条人类基因的PCR产物为靶基因制成的基因芯片, 对增生挛缩的癫痕组织与同一个体的正常皮肤组织中存在明显差别的基因 表达谱,归纳它们的基因功能分类;再根据以前的研究成果,选择细胞骨 架与运动这一群功能相似的基因,通过原位杂交技术,研究这些基因在挛 缩性癫痕与非挛缩性瘫痕中的表达分布及变化规律,分析它们对癫痕收缩 的作用;更进一步,利用重组Q—SMA反义和正义逆转录病毒,通过高体 和在体研究,探讨a—SMA在瘦瘦收缩中的作用。 主要结果如下: l.通过4例增生挛缩癫痕组织与皮肤的对比筛选发现,同体对照的差 异基因为365~447个;疲痕两两对比差异表达基因有214~三刀,3组搬痕 共同存在差别的数量为114~152,4例搬痕中都有差别97条; 2.差异表达基因涉及 13类功能组:原癌基因和抑癌基因以条>离子 通道及运输蛋白*条),细胞周期蛋白类O条X 外压反应蛋白*X 细胞骨 架和运动* 条),细胞凋亡相关的蛋白便条),DNA结合、转录O条),细 胞受体p条),免疫相关问条),细胞信号和传递蛋白日0条),代谢* 条), 蛋白翻译合成(条),发育相关(条),其它一门条); ·IX· \ 3.差异基因以上调为主,下调的仅有3条; 4.细胞骨架与运动基因出现差异表达的有 11条,但都与 a—SMA、 Vim、TM30、Profilin、BM40等关系密切; 5.这5条基因在疲痕形成3个月时有较高的表达,6各月达到高峰值, 12个月时己基本消退;非收缩性癫痕则只有低水平表达;正常皮肤则几乎 不表达; 6.这5条基因中,a—SMA表达水平高,持续时间长,阳性细胞比 例高,并在增生收缩与非收缩的癫痕中的差别比其他4条显著;细胞爬片 结果相似,仅有波形蛋白例外,它在细胞爬片在表达阳性的细胞比例稍高 于 Q—SMA。 7.a—SMA的免疫组化发现,a—SMA在3~6月时组织与细胞的 一 表达信号非常强,不但在肌成纤维细胞胞浆内有很强的分布,构成典型的 丝样结构,而且分泌到细胞外,形成网状结构。此结果以
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