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《第三军医大学》 2002年
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基于α-病毒载体的新型肿瘤基因疫苗的研究

倪兵  
【摘要】: 目前肿瘤治疗手段有手术、化疗、放疗、生物治疗和中医疗法联合应用等,但是这些方法都有缺乏肿瘤特异性、对正常组织损伤大、毒副作用大、疗效不能满意的缺陷,因而限制了它们的应用前景。现在渐渐兴起的肿瘤特异性免疫治疗,如利用肿瘤细胞和肿瘤特异性抗原表位肽,虽然是一种针对肿瘤的特异治疗方法,但这些方法本身还有许多不足之处,如激发的免疫应答强度不够和主要激发体液免疫应答等。 相对于这些第一代和第二代肿瘤疫苗,肿瘤基因疫苗可以部分克服上述缺陷。基因疫苗有许多优越性,如制备简便、免疫效应时间长、不必考虑MHC限制性问题等,并已经在很多领域包括肿瘤等疾病的防治中取得了巨大进展。但目前常规基因疫苗也有其局限性,如有些基因疫苗刺激的强度还不够大、在人和大动物中免疫效果远不能令人满意等,因此,寻求新的基因疫苗方案势在必行。目前一般基因疫苗普遍性问题是抗原蛋白表达量不够和在体转染效率不足,从而不能有效激活机体免疫应答。要克服这些不足就要对基因载体进行改良。现在许多基因疫苗的研究开始利用病毒的高效感染性和表达效率,将改造过的病毒作为基因的载体,制备高活性的病毒型基因疫苗,从而解决了目的基因表达不足和在体转染效率低的问题,并已经在许多领域取得了令人瞩目的成就。在诸多病毒载体中,α-病毒作为其中的一员,已经越来越受到人们的重视。α-病毒作为一个新型基因载体,其制作简便、易操作、宿主广泛、胞浆中的高效RNA复制和随后高水平的外源基因表达的特性,使其逐渐被人们所认识。对α-病毒作用机制的研究发现,α-病毒的复制酶可以高效催化其下游基因从RNA到RNA的复制,从而使目的基因大量表达。所以,本研究拟利用α-病毒的这些特性,制备基于α-病毒复制酶的重组质粒和重组病毒颗粒,研究这种 改良的基因载体新特性,比较重组。一病毒、含a一病毒复制酶的重组质粒 和常规重组质粒之间免疫效果的差异;同时观察 IL-12表达质粒是否对基 因疫苗有加强效应。 肿瘤基因疫苗要求有肿瘤特异的抗原基因。近十年来已经成功分离出 多种鼠或人的肿瘤特异性抗原,如小鼠门 基因和人的MAGE、BAGE、 GAGE家族等。PIA为小鼠肥大细胞瘤 P815所表达的肿瘤特异性抗原, 它是一种CT抗原,在多种小鼠肿瘤如肥大细胞瘤P815、浆细胞瘤J558 和纤维肉瘤Meth A等中表达,而在除睾丸、胎盘之外的正常组织中不表 达。因而,它成为设计和研究各种肿瘤疫苗方案的理想模型,我们也因此 选择其作为本研究的靶标,评价基干新型载体的基因疫苗免疫效果。 我们首先用 RT-PCR方法从 PSIS肿瘤细胞中扩增出 PIA基因,制备 pCI” 和含SFV复制酶的重组质粒pSMARTZaiPIA,以及重组病毒 PIA/SFV和对照重组病毒L。Z侣FV。动物实验结果显示,实验组的各种 疫苗免疫 C57BL历小鼠后,小鼠脾细胞分泌的 Thl型细胞因子*FN-Y)远 比ThZ型细胞因子(I-4)多。在PlA/SFV组中,H者的比例高达2700。PIA 特异抗体在所有组别中均未检测出。各实验组均有抗原特异的CTL生成, 但 PlA/SFV组的 CTL杀伤率最高。在 E/T比为 100时,PlA/SFV组的 CTL 杀伤率为75%。IL4 真核表达质粒同pCI” 共注射能提高后者所产生 的CTL杀伤活性,其最大杀伤率达5 5%。在保护性和治疗性实验中,60 天实验期限内,PIA/SFV的效果最好,pSMARTZde1A组次之。 在证实上述新型载体的免疫效果之后,我们又进一步将其用于人肿瘤 疫苗的研究。如前所述,MAGE-3是一种肿瘤特异性抗原,它首先在黑色 素瘤中被发现,不仅表达于大部分黑色素瘤中,而且在肺癌、食道癌、肝 细胞癌和骨肉瘤等中都有较高表达。它也是一种CT抗原,因而是肿瘤疫 苗良好靶标。但是,由于缺乏相应的人源化动物模型,所以目前基于 MAGEI的各种疫苗均是用肽或抗原冲击的DCS直接用于临床实验。但是, 当用来评价某种新型疫苗策略时,病人显然不适合作为实验模型。 现在可利用的人源化动物模型基本上是转基因小鼠。虽然转基因小鼠 ·IX· 有其优势,但其制作的复杂性,以及其本身存在的一些问题,限制了它的 应用。近年来,人一鼠嵌合模型在人源化动物模型研究领域中取得了很大进 展,并使其和转基因动物一样,成为评价疫苗效果的一种选择。因此,本 研究拟利用这种人一鼠嵌合模型*rimera)来评价我们所制备的新型基因疫苗 载体在肿瘤治疗中的作用,探讨用这种模型来评价基于人的各种疫苗的可 能性。 同样,按照前述方法制备pCI/magel、pSMARTZajmageI重组质粒和 重组病毒magel用Fv。原核表达纯化mage上蛋白,以用于ELISA分析。 BALB儿小鼠经致死性剂量断裂照射,并移植NOD/SCID /J’鼠BM细胞进 行放射保护
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R392

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【共引文献】
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