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《第三军医大学》 2002年
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TGF-β/Smad信号通路在肾小管间质纤维化中的作用及机制的实验研究

黄云剑  
【摘要】: 肾小管—间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis TIF)是多种原因(炎性和非炎性病因)引起慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同终点途径,了解其准确的发病机制以及找到有效的治疗方法是目前重要的研究课题。许多证据表明TGF-β在肾小管间质纤维化进程中起着非常重要的作用,但TGF-β诱发细胞外基质(ECM)堆积的细胞内分子机制仍然不清楚。近年发现Smads蛋白是TGF-β细胞内信号传递分子,Smads经TGF-β受体活化后,进入细胞核内与其它转录活化因子一起,调节靶基因的转录。目前Smads蛋白和下游靶基因的表达与TIF的关系仍然不清楚,因此了解TGF-β/Smads信号通路在TIF进程中的作用,对阐明TIF的发病机理并设计出新的治疗措施具有特别重要的意义。 肝细胞生长因子(HGF)是一个对肾小管上皮细胞具有强烈丝裂原活性以及细胞运动与形态调节的多效性细胞因子。研究已经发现TGF-β是HGF基因的表达的负调控因子,而HGF能拮抗TGF-β对肾小管细胞生长阻滞和小管分支形成的抑制作用。HGF还能缓解肝纤维化和促进急性肾脏损伤小管细胞的再生修复,但HGF能否缓解TIF的进程尚待进一步研究。 方法 本研究通过建立梗阻性肾病小管间质纤维化模型和原代肾小管上皮细胞培养,采用RT-PCR、Western Blot、底物酶谱法、DNA片断末端标记法、免疫组化法、脂质体介导的基因转移技术、ELISA以及病理学方法,分以下3个部分进行探讨:1)首先观察TGF-β_1及其下游靶基因(PAI-1、TIMP-1)mRNA在TIF进程中的变化特点并进行分析,以及HGF缓解TIF的机制;2)观察Smad2,3,6,7蛋白在肾脏的表达定位以及与小管间质纤维 化的关系。3节 基因转移是否能据抗TGF千l对培养肾小管细胞生长。 细胞周期以及分泌FN的影响。 结果(1)与同期假手术组相比,输尿管梗阻后第3天梗阻肾TGF书、 PAI-1、TIMP.lmRNA表达均有显著的增高,第 7.天达最高值,第 ZI天出 现回落,三者的变化规律基本一致。梗阻肾羟脯氨酸含量也呈进行性增高, 第21天达最高值。C)与ZI天梗阻组相比,HGF治疗组TGF个、PAl4。 TIMP-lmRNA表达、羟脯氨酸含量、小管细胞凋亡数明显下降,而小管 细胞增殖和 MMPZ,9活性明显提高。o组化和 Western blot证实正常肾组 织均有SmadZ,3,6,7蛋白表达。SmadZ,3蛋白表达局限于肾小管(包 括集合管和亨利氏绊),肾小球偶见。Smad6,7蛋白主要在肾小球和皮质 肾小管上皮细胞内表达,在髓质的肾小管仅有少许分布。(4)与正常大鼠相 比,梗阻后第3天SmadZ,Smad 3蛋白表达就开始增加,随着梗阻时间的 延长,表达量逐渐增加,于第 7天表达最高,ZI天出现回落。相反,Smad6, Smad 7蛋白表达却逐渐下降,第 3天出现降低,第 14天降至最低,第 21 天稍有回升八5)培养基添加 TGF巾l (10n加l)48h后,小管细胞增殖能力 明显下降,停滞于Q期的细胞数增多,细胞分泌的FN量也明显增高,相 反,Sffisd7基因转移后可明显桔抗TGF卡l对小管细胞的上述作用。 结论 IPAI-1和 TIMP.lmRNA表达增高是梗阻性肾病小管间质细胞外基 质降解减少及UF加重的重要原因之一。 2.HGF能有效缓解梗阻性肾病小管间质纤维化。HGF的抗纤维化作用 与HGF自有效下调梗阻肾TGF61、PAI-l和TIMP-llRNA表达,降低 司 管细胞凋亡以及增加肾组织MMPZ,9活性,促进肾小管细胞增殖有关。 3.正常肾组织均有SmadZ,3,6,7蛋白表达。SmadZ,3蛋白表达 局限于肾小管(包括集合管和亨利氏绊),肾小球偶见。Smad6,7蛋白主 要在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内表达。 Vlll 4.RSmads高表达和 AntiSmads蛋白表达下降可能是梗阻性肾病 TGFfl高表达导致TIF形成的细胞内分子机制。此结果为今后进一步治疗 肾小管间质纤维化提供了新的思路和目标。 5.TGF卡l可诱导肾小管上皮细胞生长停滞‘凋亡并刺激其分泌FN。 Smad7基因转移入肾小管上皮细胞能有效阻断TGF如这一作用。此结果为 进一步的体内基因治疗研究奠定了基础。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R692.6

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