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《第三军医大学》 2002年
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p27基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响和p27基因启动子活性的干预性研究

冉擘力  
【摘要】: 研究背景和目的:再狭窄(restenosis,RS)严重制约了经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的远期疗效。其病理基础是新生内膜的形成;而血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移则是其主要成因。有许多因素如细胞因子、生长因子等参与此过程。因此,VSMC是RS的主要作用细胞,也是RS防治研究最重要的靶细胞。随着对疾病分子水平机理研究的不断深入,基因治疗已成为很多疾病防治及医学研究工作新的切入点。因此,从基因水平认识其发生、发展,探索RS的发生机制及有效基因防治方法已成为心血管病学界研究的热门课题之一。 细胞增殖受细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的促进,受细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)的抑制。p27是一重要的CKI,在细胞周期的调节中占据了重要地位,被喻为“分子开关”,它主要抑制cyclinE-CDK_2和cyclin D-CDK_2等G_1期复合物,使细胞不能通过G_1期,从而在G_1/S和G_2/M处构筑了两道“堤坝”;当由于种种原因使p27大量降解时,细胞就可以顺利地实现G_1/S转换而进入恶性增殖。那么,能否通过基因技术使p27表达增加而达到抑制VSMC增殖和迁移的目的?目前在心血管病领域中有关这方面的研究报道较少。基于这一认识,本研究拟通过转基因的方法使培养VSMC过度表达p27,了解其对血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)刺激培养大鼠VSMC引起的增殖和迁移等生物学行为的影响。同时观察PDGF-BB和抗增殖药SDZ RAD干预VSMC后p27基因启动子活性的变化,从基因转录水平探讨p27表达的调节机制及其在RS发病机制及防治中的意义。 研究方法:本实验以组织块贴壁法培养的大鼠主动脉VSMC为实验 搏士研究生论文 p27基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响和 p27基因启动子活性的干预性研究 平台,采用位置特异性重组方法构建携带人p27 CDNA的腺病毒载体,通 过293 细胞扩增,纯化制取高滴度腺病毒转染液并转染培养VSMC。以 流式细胞术、免疫细胞化学法及RTPCR分别检测P27、PZI、PCNA、 CDKZ、Cyclln E、c-fos、c。myc禾 connexin43蛋白在 VSMC的表达,以 及p27、p21、PCNA、c-fos、c-myc mRNA的表达;用四哩盐(MTT广色 试验、h标记的胸腺啼陡核苦(‘H*dR)掺入试验、流式细胞术及改良 Boyden\趋化小室等方法检测P27转基因表达后VSMC增殖和迁移等生 物学特性的变化;以上实验均用PDGF习B干预。另外,运用含p27基因 启动子的荧光报告质粒pXp27瞬时转染培养VSMC,用氯霉素乙酚基转 移酶(CAT)ELISA法检测 PDGF一BB和抗增殖药 SDZ RAD干预后 p27 基因启动子的活性变化。 研究结果:①用位置特异性重组技术成功构建了携带人p27 CDNA的 腺病毒载体 Ad.CMV—p27。其滴度约 5 x l}fu/ml。最佳 MOI为 40; ②用组织块贴壁法成功培养了原代大鼠主动脉VSMC;③Ad二CMV—p27 转染VSMC后,用流式细胞仪、免疫细胞化学法和RT-PCR法等方法检 测 p27蛋白和 mRNA表达水平均证实 p27在 VSMC有显著表达,且随转 染时间延长而逐渐增高,24小时达峰值约 85.sl%,可持续表达 5~7天;④ MTT试验显示,PDGF-BB刺檄后 MTT值随 PDGF-BB浓度增加而升 高,PDGF8B浓度增加到 10ng/ml 时,MTT吸光度值显著增加到 门石2印刀3),以后随浓度增加而略有升高,但不显著;转染p27后可 显著抑制 PDGFBB刺激引起的细胞增殖…叼刀 1)。⑤通过流式细胞检 测 VSMC增殖周期发现,转染p27后可显著增加 GO心 期细胞及减少 PDGF-BB刺激引起的细胞 S期和 GZ/M期比例明显增加(p<0.of)。⑤ 屯1dR掺入实验提示,转染 p27后可明显抑制血清和 PDGF8B刺激对 VSMC 的DNA 合成的诱导作用(抑制率分别为 34.4%和 35厂%, P叩刀引。①改良Boyden七趋化小室检测VSMC跨膜迁移数的结果表 明,PDGFIB刺激VSMC迁移在一定浓度范围内*10ng/ml)呈浓度依 赖性增加,p27过度表达可明显抑制PDGFBB刺激引起的VSMC迁移。 VI 博土研究生论文p27基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影叼和p27基因启动子活性的干预性研究 ③PDGFEB刺激后,p27蛋白阳性表达率和mRNA表达强度显著下 降为4.23%和 1*7,p21下降为 15*6%和 1*(P<0*1);转染P27后使P27 蛋白阳性表达率和 mRNA 表达强度又分别增加至 3 3.gi%和 2.*(旷0.01):*1 分别增加至50.*%和2.3。给予P**FSB刺激后, VSMC中 CDKZ、PCNA、Cyclin E、c-fos、c-myc蛋白及连接蛋白 Cx43 阳性颗粒均显著增多…<0刀1卜 其中,pCNA、G-fOS及 C-myC mRNA表达 强度也显著增加O叼刀 1X 但转染 p27后其增高程度显著低于未转染组 …<0刀5)。 ③CAT ELISA结果提示,SDZ RAD和PDGF-BB分别能显著增加和 降低 p27基因启动子活性(P<0*5-0* 1)。 研究结论:①本实验构建的腺病毒载体AdCMV—P27可高效介导 p27基因在原代大鼠主动脉VSMC上表达;②AdCMV—p27转染使 VSMC过度表达p27,可抑制有丝分裂原刺激引起的VSMC增殖和
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