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神经干细胞的分化调控及BDNF基因修饰后对大鼠脊髓损伤修复的研究

李巍  
【摘要】: 神经干细胞(neural stem cell,NSC)是中枢神经系统内存在的具有自我更新能力和多种分化潜能的一种未分化细胞。目前的研究表明,神经干细胞可以在体外大量增殖,并可诱导分化为中枢神经系统内的三种主要细胞—神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,但其增殖、分化机制仍不清楚;脊髓损伤修复一直是神经科学关注的焦点之一,其治疗的主要策略,一方面是给予足量外源性神经营养因子,改善神经再生环境,促进神经再生;另一方面是组织移植治疗,以往常用的移植材料多为胚胎脑组织、外周神经组织以及某些非神经组织等,虽然取得了一些进展,但仍有许多问题。 因此,本研究利用细胞培养技术、DNA芯片技术、基因转染技术、流式细胞计数、HRP逆行示踪、原位杂交和免疫组化等方法,分离培养了人和大鼠的神经干细胞,并制备了BDNF基因修饰的大鼠神经干细胞;观察了多种因素条件下,神经干细胞的分化过程及其基因变化;探讨了神经干细胞和BDNF基因修饰神经干细胞作为移植材料用于脊髓损伤修复的作用。结果如下: 一、通过无血清培养技术,分离培养了人和大鼠胚胎脑皮层细胞,经过Nestin鉴定和5%胎牛血清诱导分化后,行GFAP、NF-200免疫组化染色,证明我们所获得的细胞具有体外增殖和多向分化潜能,为中枢神经系统的神经干细胞;用含有BDNF基因的复制缺陷型腺病毒感染所分离的大鼠神经干细胞,经过G418筛选,BDNF原位杂交鉴定,获得了大鼠BDNF基因修饰神经干细胞。 二、用不同浓度胎牛血清诱导入神经干细胞分化的结果显示,胎牛血清浓度与神经干细胞向神经胶质细胞方向分化程度成正比。 三、微波辐射对人神经干细胞的增殖、分化和凋亡均有影响,且呈一 定的量效关系。微波辐射后,人神经干细胞的分裂增殖能力下降;微波辐 射后的神经干细胞在诱导分化时很难贴壁,大部分细胞漂浮在培养基中, 且死亡细胞较多。但一旦贴壁分化,它们分化后所形成的神经元和神经胶 质细胞的比例与辐射前相比变化不大。经过TUNEL检测,微波辐射能诱 一 导人神经干细胞凋亡。 四、将 10%胎牛血清诱导神经干细胞分化 7天后的细胞经 DNA芯片 检测,获得了 1000多种差异表达基因,其中明显上调的基因 13 8个,明显 下调的基因 179个。基因种类覆盖了细胞周期、发育与分化、受体与通道。 细胞骨架、细胞间信号传导、生长因子、原癌基因和抑癌基因、转录和翻译 调节、ESTs(。Pressed sequence tagd、代谢调节、蛋白运输等功能相关基因。 五、用BDW基因修饰前后的神经干细胞移植入大鼠脊髓腰4全横断 损伤部位,经过*卫染色,X唱al组化染色,BDW原位杂交和 BD地,一 GFAP,NF上00兔疫组化和 HAI)逆行示踪等方法检测显示,神经干细胞和 BD地基因修饰神经干细胞均能够在宿主脊髓中存活,并与宿主整合良好; BDNF基因修饰神经干细胞移植组见有X唱al组化染色阳性细胞;在损伤 处移植细胞分化为神经元和神经胶质细胞,并可见许多W-200阳性神经纤 维;BDM原位杂交和免疫组化结果显示,BDNF强烈表达;经坐骨神经 iEp逆行示踪显示,移植1月后,紧靠损伤段头侧,见有少量HRP阳性 神经元,以后随时间逐渐增多。以上各项检测及大鼠运动功能检查结果显 示,在BDW基因修饰神经干细胞移植组均优于单纯神经干细胞移植组以 及手术对照组。 本研究结果提示: l.神经干细胞的增殖、分化受到许多因素的影响及众多基因的调节。 2.神经干细胞及BDN’F基因修饰神经干细胞移植后,可在宿主体内 存活、增殖分化,与宿主体脊髓部分整合。因此,可考虑将其作为未来脊 髓损伤的修复途径之一。


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