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《第三军医大学》 2002年
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血管内皮细胞CASK相关信号通路的研究

张方  
【摘要】: 血管内皮细胞(VEC)的增殖调控在血管生成、肿瘤发生以及创伤后组织修复等过程中具有重要意义。分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)蛋白在血管内皮增殖调控中发挥重要作用。Id蛋白和bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子结合形成无DNA结合功能的异二聚体,后者抑制了细胞增殖和分化相关基因的转录活性,从而达到抑制细胞分化和促进细胞增殖的目的。1999年Nature杂志评价Id蛋白为调控细胞分化的刹车(brake),Id蛋白相关的信号转导途径的研究具有重要意义。hCASK(human calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase)基因于1997年被发现,CASK属于膜相关鸟氨酸激酶 (membrane-associated guanylate kinase,MAGUK),为细胞支架蛋白(scaffolding protein)。2000年,我室首次在酵母中发现hCASK的GUK 结构域与人Id1 发生特异的结合,为我们研究CASK的功能及下游信号途径提供了新的思路。 实验目的:1. 进一步在人血管内皮细胞中证实CASK和Id1结合,为研究CASK和Id1的信号途径奠定基础。 2. 探讨CASK-Id1的生物学效应。3. 探讨胞外信号bFGF与CASK-Id1通路的关系及其效应机制。 材料和方法:1. 原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离和培养:用0.25%胰酶消化新生胎儿脐静脉10分钟,离心收集消化液中的人脐静脉内皮细胞,加入 M199培养基(含10%FCS),于37℃、5%CO2 孵箱培养。2. 人脐静脉内皮细胞株ECV304和稳定转染人CASK全长的ECV304细胞(IPTG诱导表达),细胞培养方法同上。 3. 免疫共沉淀实验:用CASK抗体与ECV304细胞和原代HUVEC裂解液孵育后,IgG-CASK免疫复合物及其结合蛋白被琼脂糖颗粒(Agarose)共沉淀,将所得的沉淀行蛋白质免疫印迹(western blotting),用Id1抗体检测Id1的存在。 4. 激光共聚焦实 WP=9 验:不同的荧光标记抗体检测CASK和Id1,激光共聚焦显微镜下观察原代HUVEC中CASK和Id1的细胞亚定位。 5. bFGF和反义寡核苷酸作用ECV304细胞CASK和Id1的表达情况 (western blotting): ECV304细胞经血清饥饿6h,用不同浓度的bFGF刺激细胞8h,观察在在不同浓度bFGF刺激下CASK和Id1的表达情况;检测IPTG诱导CASK表达以及反义寡核苷酸阻断CASK和Id1表达情况。 6. RT-PCR:IPTG诱导CASK表达后,ECV304细胞中p53 mRNA表达量的变化。 7. 凝胶迁移率电泳实验(EMSA):IPTG诱导CASK在ECV304细胞过量表达后,EMSA观察不同时相点,p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况;广谱性的bHLH转录因子E12/E47抗体阻滞迁移率实验,观察该转录因子是否参与了E-box的结合;Id1经反义寡核苷酸阻断后,观察p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况;不同浓度bFGF刺激ECV304细胞后,观察p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合情况。 实验结果: 1. CASK与Id1在人内皮细胞中的特异性结合: 1) 免疫共沉淀实验证实了ECV304细胞、原代HUVEC中存在着CASK和 Id1的天然结合。 2) 激光共聚焦实验结果表明:原代HUVEC中可见CASK和Id1在胞浆近核膜处结合形成颗粒状复合物。 2. bFGF以及反义寡核苷酸处理对ECV304细胞表达CASK与Id1的影响: western blotting结果显示:IPTG诱导后,CASK表达明显增加;Id1反义寡核苷酸处理后,Id1表达明显下调,而CASK反义寡核苷酸不能阻断内源性的CASK表达;bFGF刺激ECV304细胞与CASK生成存在着量效关系: 100,200,400 ng/ml的bFGF浓度刺激,CASK表达量无差异,而600 ng/ml以上的浓度刺激后CASK表达量增加;不同浓度的bFGF刺激ECV304细胞,Id1的表达量基本一致。 3. CASK-Id1通路对p53 mRNA转录的调节: WP=10 1) CASK上调p53 mRNA的表达 RT-PCR结果显示: IPTG诱导8h后,ECV304细胞中p53 mRNA的表达即增加,12h达到高峰,以后逐渐下降,48 h已基本恢复正常。 2) CASK通过Id1调节p53启动子E-box与相关bHLH转录因子的结合 EMSA结果显示:IPTG诱导CASK在ECV304细胞表达6h后,p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合活性增强,8h达到峰值,24 h基本恢复正常;Id1反义寡核苷酸阻断Id1表达后,该 E-box与相关bHLH转录因子结合活性也增加,现象与CASK的调节作用一致;IPTG诱导表达CASK的同时,用Id1反义寡核苷酸阻断Id1表达,出现了“叠加效应”,即E-box与相关bHLH转录因子结合活性比上述单因素作用效应更强;抗体阻滞迁移率实验表明广谱性的bHLH转录因子E12/E47 未参与该p53启动子中E-box的结合。 3) bFGF调节p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子结合活性 不同浓度的bFGF(100,200,400,600,800,1,000ng/ml)作用 ECV304 细胞,p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子结合活性呈波动性变化:bFGF的浓度为400ng/ml时,结合活性最弱,低于正常对照;大于600 ng/ml bFGF的浓度作用后,结合活性明显增大。 实验结论 1.人血管内皮细胞中存在着天然的CASK和Id1的相互作用。 2.CASK能上调p53 mRNA的表达。 3.CASK-Id1通路可能通过调控p53启动子中E-box与相关bHLH转录因子的结合调节p53 mRNA转录,该转录因子可能是某一血管内皮细胞特有的bHLH转录因子。 4.大于600ng/ml 高浓度的bFGF刺激ECV304细胞,CASK的蛋白
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R602

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