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《第三军医大学》 2003年
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新型阳离子脂质体的合成及人β防御素2基因转染和表达的研究

雷撼  
【摘要】: 作为基因转染载体,阳离子脂质体虽然具有许多优点,但其仍然存在基因转染效率较低、易受多种因素影响等问题,因此人们在不断的寻找和研究新的、基因转染效率高而稳定的阳离子脂质体。人β防御素2(hBD-2)是人体细胞分泌的具有抗微生物活性的短肽,在皮肤、肺部粘膜的防御上起着重要的作用。本研究主要目的是①通过有机化学合成法合成制备新的高基因转染效率的阳离子脂质体,对其在体外培养细胞和体内细胞的转染条件和模式进行筛选和评估;②建立呼吸道雾化吸入的基因转染模式;③用人工合成的方法合成hBD-2的结构基因并构建其重组真核表达载体;④利用新型阳离子脂质体将hBD-2重组真核表达载体转染至体内、外气道上皮细胞,对其表达进行研究,以寻求一个可行的新的抗感染基因治疗途径。 方法:(1)用有机化学合成法合成新型细胞转染素:N4-精胺胆固醇羰酰氨,并对其结构进行鉴定。(2)采用薄膜法制备以N4-精胺胆固醇羰酰氨为阳性成分的新型阳离子脂质体,通过电镜观察、凝胶电泳确定转染条件,并用荧光质粒载体对肺腺癌SPC细胞进行转染,评估其转染效率。(3)根据Genebank中的hBD-2结构基因序列,设计合成三条长链引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因;用双酶切定向克隆的方法构建重组真核表达载体pLXSN-hBD2。(4)用重组真核表达载体pLXSN-hBD2通过新型阳离子脂质体对大鼠气道上皮细胞进行转染,用PCR、Western blot检测hBD-2基因的整合与表达。(5)通过雾化吸入模式对新型阳离子脂质体在体内转染pLXSN-hBD2进行研究。 结果:(1)成功合成出新型细胞转染素N4-精胺胆固醇羰酰氨,质谱仪、红外光谱仪、核磁共振分析证明结构正确。(2)电镜下显示用薄膜法制备的新型阳离子脂质体为0.1μm -1μm的圆形微囊泡结构,在浓度为0.25mg/ml、脂质体/质粒为6-8:1左右时转染效率高达60.5%。(3)凝胶电泳及测序分析结果显示,PCR延伸扩增法合成的hBD-2基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上。(4)重组载体pLXSN-hBD2与大鼠气道上皮细胞基因组DNA成功整合,并成功获得表达。(5)新型阳离子脂质体通过雾化吸入将pLXSN-hBD2质粒转染进体内气道上皮细胞并获得表达,转染后2天、6天和15天的Western blot检测结果表明hBD-2有持续表达,且逐渐降低,到21天基本结束。 WP=8 结论:(1)通过有机化学的方法,合成了高纯度的目标化合物N4-精胺胆固醇羰酰氨。(2)成功制备了以N4-精胺胆固醇羰酰氨为阳性成分的新型阳离子脂质体,并且该脂质体在适当条件下具有良好的转染活性。(3)成功合成hBD-2基因并构建其重组真核表达载体。(4)通过新型阳离子脂质体,重组真核表达载体pLXSN-hBD2被成功整合进体外培养的大鼠气道上皮细胞基因组DNA中,并表达hBD-2。(5)通过雾化吸入能将pLXSN-hBD2质粒转染进大鼠体内气道上皮细胞并获得表达,并且hBD-2的表达能持续一段时间。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

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