收藏本站
《第三军医大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

肝干细胞的生长、分化、凋亡调控及其信号转导研究

姚鹏  
【摘要】: 在成熟肝脏的Herring狭隙存在一种具有双向分化潜能的细胞,在严重肝损伤或肝细胞的再生受到抑制时,能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞, 称为肝干细胞。对肝损伤修复具有重要的意义 。 肝细胞生长因子(HGF)是一种具有广泛生物功能的细胞因子,能够促进肝细胞等多种细胞的生长增殖,诱导细胞的离散。在内皮细胞和肿瘤细胞,HGF能够保护细胞免受毒性物质、射线及炎性因子等引起的细胞凋亡,还能够拮抗Fas及胆酸诱导的肝细胞凋亡。在肝干细胞的增殖、分化及凋亡过程中, HGF也起着重要的调控作用。然而,HGF如何参与肝干细胞的调控及其信号传导机制尚不十分清楚。 NF-κB是一种调节免疫、炎症及生长反应等多种基因的重要调控因子,在细胞的生存和凋亡调控中起着极其关键的作用。通常NF-κB处于无活性状态,当受到外界各种刺激时,与其结合的抑制蛋白IκBa首先发生磷酸化及降解。游离的NF-κB发生核转移并激活靶基因的转录。在多种细胞,抑制NF- κB能够导致细胞的凋亡,而NF- κB活化可以使细胞生存。在肝细胞, NF- κB在抑制TNF介导的凋亡中起重要作用。有报道,细胞因子能够通过激活NF- κB途径而刺激细胞的生存,细胞因子与NF- κB可能有着密切的功能性联系。NF- κB是否在肝干细胞的增殖及凋亡调控中亦起着关键作用,我们将对此进行研究探讨。此外,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径被认为在细胞生存及抗凋亡信号转导中起重要作用。PI3K和MAPK途径是否也参与肝干细胞的增殖、分化及凋亡的调控?这些信号途径与NF- κB之间存在怎样的联系? 为此我们用大鼠来源的肝干细胞WB F-344 作为模型,研究细胞因子在体外对肝干细胞生长、分化及凋亡的调控; HGF对WB F-344细胞的抗凋亡作用及离散效应;NF- κB 在HGF介导的信号转导中的作用与 WP=16 调控;ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AK等信号途径在HGF介导的信号转导中的作用;以及这些信号转导途径之间的相互联系和作用机制。 方 法 1. 检测细胞因子对肝干细胞的调控作用 WB F-344细胞用不同浓度的细胞因子HGF、EGF、FGF、胰岛素、IL-6、TNF-α作用,24小时后,通过H3TDR掺入法检测细胞因子对肝干细胞增殖的影响;提取WB F-344细胞蛋白,用Western blot方法检测WB F-344细胞表面细胞因子受体HGF受体(c-met)、EGF受体、FGF-α受体和TGF-?等受体蛋白的表达; 2. WB F-344细胞体外诱导分化 WB F-344 细胞以5×103/孔接种于6孔培养板,8h后换分化培养体系:高糖DMEM、10%胎牛血清、HGF 10ng~50ng/ml、EGF 20ng/ml、Isulin 1ug/ml、地塞米松(Dex) 1(M。1-5天HGF用50ng/ml,以后改为10ng/ml维持,每3天半量换液一次,连续培养。在不同时间收集分化培养的细胞,提取RNA, 逆转录PCR检测细胞表面标志。PCR条件:94℃ 1min 58℃ 1min 72℃ 1min,35循环。ALB上游引物 :5′ AAG GCA CCC CGA TTA CTC CG 3′下游引物:3′TGC GAA GTC ACC CAT CAC CG 5′,AFP 上游引物:5′CAG TGA GGA GAA ACG GTC CG 3′下游引物:3′ATG GTC TGT AGG GCT CGG CC 5′。 3. HGF的抗凋亡作用及离散作用 为检测HGF对凋亡的保护作用。WB F-344细胞用ActD (300nmol)预处理 30 min,然后用TNF-α(100ng/ml)诱导凋亡,同时加入或不加入不同浓度的HGF (0,10,20,40,80ng/ml)。24小时后,提取细胞DNA或收集细胞,通过DNA电泳或流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡。进一步,WB F-344细胞用HGF(40ng/ml)作用24hr后,用PBS洗涤,95%乙醇固定,用溶于20%乙醇的终浓度为0.2%的结晶紫染色,风干镜检,照相,检测HGF的离散效应。 4. HGF 刺激ERK, p38MAPK, PI3K/Akt信号转导途径的激活 WB F-344 细胞在含0.5% 血清的培养液中饥饿 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间(0、5、15、30、60、120min),通过western blotting 检测 ERK, p38MAPK, Akt等信号分子及其磷酸化蛋白(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)的表达。 HGF激活NF-κB结合活性和转录活性 (A)我们首先检测HGF对NF-κB DNA结合活性的调节。 WB F-344细胞 用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间(0,15,30,60,120Min),然后提取核蛋白,P32标记NF-κB WP=17 5. 寡核苷酸探针,通过EMSA方法检测NF-κB的DNA结合活性。 (B)进一步检测HGF促进NF-κB 的转录活性,我们用 NF-κB 报告基因质粒(BD Great EscA PeTM SEAP vector)瞬时转染WB F-344细胞,这种质粒包含一个与NF-κB结合位点相连的SEPA荧光报告基因,转染细胞然后用不同浓度的HGF(0,10,20,40ng/ml)刺激 8小时, 通过BD Great EscA PeTM SEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性。(C)检测 I(B(磷酸化和降解 用 HGF (40ng/ml)作用WB F-344细胞,在不同时间(0,15,30,60,120Min)提取蛋白,通过western blotting检测 I(B(。 6. NF-κB激活在HGF介导的抗凋亡效应中的作用 (A)首先用NF-κB的特异抑制剂 BAY 11-7082 和 ASA阻断NF-κB途径,然后在HGF存在下用ActD/TNF-α诱导细胞凋亡, 通流式细胞仪检测细胞凋亡。(B)用不同的抑制剂分别阻断ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信号途径,然后通过流式细胞仪检测HGF对TN
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R575

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 龙江,郭翠霞,郭雁宾;肝干细胞的研究现状及其在肝病方面的应用前景[J];首都医药;2003年22期
2 邹清雁,张宜俊,孔祥平,张淑莲,郑曲波,肖荣,罗峰;大鼠肝干细胞的分离培养[J];实用肝脏病杂志;2000年04期
3 周主青;肝干细胞的研究进展(文献综述)[J];国外医学.外科学分册;2004年01期
4 蒋吉英,李爱冬,周鸿鹰,梅妍,杨淑霞,洪华容,宋红瑞,羊惠君;第3~5周人胚肝的细胞特征和生长因子及受体表达的研究[J];生物医学工程学杂志;2004年06期
5 于冰,姜海行;骨髓源性肝干细胞研究进展[J];广西医学;2005年03期
6 苏娟,朱海英,李文林,姚玉成,刘红,王新民,胡以平,余宏宇;成体小鼠肝干细胞的长期体外培养和体内分化研究[J];第二军医大学学报;2002年11期
7 廖彩仙;骨髓型肝干细胞[J];中华肝胆外科杂志;2003年06期
8 车媛梅,张一;肝干细胞[J];江西医学检验;2004年05期
9 胡国信,张吉翔,刘晶美;干细胞和肝干细胞研究进展[J];实用临床医学;2002年05期
10 张淑莲,曾平鲁,肖荣,孔祥平,张宜俊,邹清雁;肝干细胞分离培养条件的筛选[J];肝脏;2003年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王妮妍;张珊珊;陈东红;魏颖;俞一鸣;王学路;;植物中油菜素内酯受体BRI1的调节机制及信号转导[A];2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编[C];2007年
2 苏晓瑜;吕媛婧;刘虹辰;阮铮;王学锋;陈赛娟;奚晓东;;整合素β3胞浆段末端序列在双向信号转导中的作用及其机制[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
3 张岗;董艳铃;王晓杰;黄丽丽;康振生;;小麦成株抗条锈性的分子机制研究[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年
4 周建伟;;JWA基因通过NFI结合位点特异性应答氧化应激所致的DNA损伤[A];中国毒理学会第四届全国学术会议论文(摘要)集[C];2005年
5 于瑜;贾晓明;;细胞连接和信号转导在低温保存皮肤方面的研究[A];第五届全国低温生物医学及器械学术大会会议论文集[C];2006年
6 高晓琴;李荣山;;大鼠肾脏缺血预处理中COX-2和iN-OS间信号转导关系的研究[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
7 谢丛华;秦琴;曹传华;周福祥;戴静;高敏;周云峰;;信号转导子与转录活化子6活化状态与细胞凋亡和放射敏感性的关系[A];2007第六届全国放射肿瘤学学术年会论文集[C];2007年
8 周学龙;郁丽娜;严敏;;EphBs受体参与疼痛信号转导的分子机制[A];浙江省医学会疼痛学分会成立大会暨首届浙江省医学会疼痛学分会学术年会论文汇编[C];2011年
9 韩峰;刘璐璐;刘启兵;许雪娇;黄继云;颜森泉;楼宜嘉;;蛋白质酪氨酸硝基化介导脑微血管损伤的分子机制研究[A];中国毒理学会第五次全国学术大会论文集[C];2009年
10 张德昌;陆久怡;叶菜英;谢志华;;阿片受体激活信号转导及其与耐受依赖新机理的初步研究[A];中国药理学会第八次全国代表大会暨全国药理学术会议论文摘要汇编[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 陈昌发;我市成功实施首例肝干细胞移植手术[N];三明日报;2008年
2 美通;MCET与MBL公司签署肝干细胞研究协议[N];中国医药报;2009年
3 ;蛋白激酶在阿片类物质介导的信号转导和耐受依赖中的作用[N];中国医药报;2003年
4 中国科学院研究生院 吴晓东;植物生理学的四种趋势[N];光明日报;2002年
5 刘海英;融合生物机制的纳米电子装置问世[N];科技日报;2009年
6 海 霞;用分子生物学解读中医奥秘[N];中国中医药报;2004年
7 张鹏 本报记者 唐先武;我要做一个“立体”学者[N];科技日报;2011年
8 ;调控细胞信号转导开发治疗肿瘤新药[N];中国医药报;2002年
9 仇逸 陈祖亮;上海基因治疗疤痕研究取得突破[N];中国医药报;2002年
10 周清春;骨髓移植:用自己的造血干细胞[N];科技日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 姚鹏;肝干细胞的生长、分化、凋亡调控及其信号转导研究[D];第三军医大学;2003年
2 王小中;诱骗寡核苷酸靶向阻断STAT5逆转白血病K562细胞恶性表型[D];重庆医科大学;2005年
3 何飞;Notch-Deltal对人牙髓干细胞增殖及分化影响的实验研究[D];第四军医大学;2004年
4 郑祥毅;PI3K/Akt信号通路在肾缺血再灌注损伤中的调控作用[D];浙江大学;2005年
5 陈旭红;大鼠脑纹状体边缘区参与学习记忆的分子机制的研究[D];第一军医大学;2005年
6 万晶宏;促凋亡蛋白(BclGs)的信号转导机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
7 郝嘉;Pyk_2在心肌间质纤维化中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2006年
8 刘联;E-钙粘素介导的细胞黏附对卵巢癌细胞表皮生长因子受体(EGFR)的激活及其信号转导[D];山东大学;2006年
9 刘金元;青蒿琥酯抗实验性肝纤维化机理的探索性研究[D];广州中医药大学;2008年
10 霍海蓉;脂质筏/质膜微囊在细胞膜受体信号转导中的作用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邓治;伤害对巴西橡胶树胶乳中磷脂酶A_2的影响[D];华南热带农业大学;2004年
2 申严;MAPK、PKB调节γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在慢性阻塞性肺疾病中的作用[D];南华大学;2005年
3 王晶波;黄瓜体内酚性抗病物质合成和诱导信号转导相关机制的实验研究[D];重庆大学;2005年
4 刘俊;阻断磷脂酶C-γ1信号通路对大肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其信号机制初步探讨[D];第一军医大学;2005年
5 李春艳;两种红树—秋茄和木榄幼苗抗盐生理生化基础研究[D];北京林业大学;2005年
6 潘飞燕;基于甾类激素信号转导的药物筛选模型的建立[D];南京师范大学;2005年
7 刘红英;实验性ARDS大鼠小肠Gq/11蛋白的变化及其与异丙酚的相关性[D];新疆医科大学;2005年
8 吴瑞锋;钙离子通道对人食管下括约肌舒缩机制影响的研究进展[D];河北医科大学;2008年
9 曲楠;腺苷A2A受体激动剂经P38MAPK途径对冠状动脉微栓塞致心肌损伤的保护作用[D];广西医科大学;2009年
10 邵利娟;普罗布考对氧化诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡的研究[D];山东大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026