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《第三军医大学》 2003年
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脂多糖结合蛋白多抗对内毒素急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响

张德明  
【摘要】: 急性肺损伤是临床觉常见的呼吸系统急危重症之一,感染是该病的主要诱因,G-菌感染致急性肺损伤,主要是由于内毒素(LPS, Lipopolysaccharide)活化炎性细胞释放大量炎症因子所致。研究LPS信号通路及其阻断效应,对帮助了解急性肺损伤的发生机理,寻找急性肺损伤治疗的新靶位,具有重要的理论与实际意义。既往研究表明LPS胞外的信号转导是通过脂多糖结合蛋白LBP呈递给CD+14来实现,而胞内则是通过IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase ,IRAK)、TNF-α受体相关激酶6(TNF-α receptor associated kinase 6 ,TRAK-6)使IκB激活,活化的IκB再使NF-κB磷酸化后转位,炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18等)开始转录、翻译和表达。LPS信号由胞外向胞内的转导即跨膜转导一直尚不明确,近年TLR4的发现提供了新的线索,它作为LPS靶细胞膜上的跨膜受体蛋白,其胞外的亮氨酸重复序列可以识别和结合LPS,而胞内与IL-1β同源的尾状结构域,为将LPS信号呈递给IL-1β提供了可能性,故TLR4是LPS信号转导的关键靶分子。TLR4的表达与功能完整直接影响LPS信号传导效能,反之,降低TLR4的表达与功能,有助于减少下游炎症因子的分泌与释放,企以减轻LPS所致的肺损伤。 不同个体感染G-菌后临床表现轻重不一,说明个体对LPS的反应性不同,即对LPS耐受性(Tolerance or Desensization)存在差异。LPS耐受性机理还不完全清楚,它与机体的免疫力,LPS的内化,LPS信号转导效率等综合因素有关,其中LPS 靶细胞膜上的跨膜受体TLR4的结构与功能及其介导的信号通路,与LPS 耐受性关系尤其密切。TLR4的表达与LPS耐受性的关系尚不明了,研究实有必要。降低TLR4的表达从而提高对LPS的耐受性,有望增强机体对LPS的抵抗力。 脂多糖结合蛋白(LBP)是LPS的“载体”,主要负责运送LPS至靶细胞,同时对PS炎症反应具有增敏作用,其抗体可能减轻上述作用,此作用是否与降低LPS信号传导效能有关,值得探究。目前尚无商品化的LBP及抗体,分离、纯化LBP并制备其抗体很有必要。 本课题通过以下几个方面研究LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响,为阐明TLR4信号通路在LPS急性肺损伤的作用与地位,LBP WP=10 抗体治疗LPS急性肺损伤提供理论依据。 1. 经50%饱和硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析、MonoQ阴离子交换层析从大鼠急性期血清分离、纯化出LBP,并以其免疫新西兰白兔,分离出抗血清后粗制成LBP多抗。为进一步探讨LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响奠定基础。 2. 运用RT-PCR与Western Blot的方法,观察LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达水平及下游炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18基因表达水平变化的作用。从基因与分子水平探讨LBP多抗对TLR4介导的LPS信号通路的影响。 3. 运用RT-PCR与Western Blot的方法,观察LPS二次刺激大鼠肺泡巨噬细胞后LPS大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达及下游炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18基因水平表达的变化及LBP多抗对它们的影响,探讨LPS耐受性与TLR4介导的LPS信号通路的关系及LBP多抗对LPS耐受性的影响。 实验结果显示:①从400ml大鼠急性期血清中分离、纯化到1134ug大鼠LBP,纯化倍数达1570倍。纯化的LBP在SDS-PAGE的60KD处呈单一条带,并可明显增强FITC-LPS与ACM的结合。②用纯化的LBP免疫新西兰白兔,经过一周的基础免疫与近三个月的强化免疫,共获得兔抗大鼠抗血清85ml,经饱和硫酸铵梯度盐析、PEG6000浓缩,获得3ml共1560ug多抗,该多抗能阻断LBP与FITC-LPS的结合 ,并经Western Blot检验为LBP多抗。③LBP多抗能降低大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达水平及IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α基因表达水平。④LPS二次重复刺激大鼠肺泡巨噬细胞后,TLR4基因与蛋白表达水平及IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α基因表达水平均下降,LBP多抗使它们进一步降低。 以上结果表明:①经50%饱和硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层、MonoQ阴离子交换层析可以从大鼠急性期血清分离、纯化到LBP。②用我们纯化的LBP免疫新西兰白兔,三个月后可产生LBP多抗。③LBP多抗能通过降低TLR4的表达,降低TLR4介导的LPS信号转导效能,从而可能减少IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α等炎症因子的分泌。④LPS二次重复刺激大鼠肺泡巨噬细胞,可使其对LPS产生耐受性。⑤LBP多抗进一步降低TLR4介导的LPS信号转导效能,提高大鼠肺泡巨噬细胞对LPS的耐受性,降低LPS介导的炎症反应性,可能提高机体对G-菌感染的抵抗力。⑥LBP多抗具有治疗G-菌感染所致的炎性疾病如SIRS、ALI、ARDS的潜在可能。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R563

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