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《第三军医大学》 2003年
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内毒素结合肽EBP基因的克隆表达及其内毒素拮抗效应研究

麻莉  
【摘要】: 研究表明,由细菌内毒素/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的细胞激活反应和活性物质释放很大程度上有赖于脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharides binding protein,LBP)和CD14的参与。LBP是60kD的血清糖蛋白,其基因由14个外显子编码,全长基因28.5kb,cDNA长约1.5kb。LBP的结构与功能关系研究显示,其与LPS的结合位点在其氨基末端,与CD14的结合位点在其羧基末端,从而形成LPS-LBP-CD14三联复合物,LBP起着催化放大LPS启动单核/巨噬细胞分泌炎性介质和细胞因子的作用。经修饰改造的氨基端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)是一种分子量为27kD、含有亲代分子的197个氨基酸的多肽,它能更有效地结合LPS,但不能转移LPS到CD14,从而可阻止LPS-LBP-CD14的形成,进而抑制单核/巨噬细胞炎性介质和细胞因子的过度分泌。我们通过对NH-LBP的结构分析,认为内毒素特异结合区域定位在109~125残基之间,共含有17个氨基酸。为了寻找一种拮抗内毒素活性更高,且体内应用安全可靠的内毒素拮抗剂,本研究根据报道的人NH-LBP基因序列,在其特异的LPS结合区域加以适当改建,并最大限度地利用大肠杆菌偏爱的密码子,设计新的内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)基因片段;通过基因克隆等方法,选择原核表达系统,并对目的蛋白进行分离纯化,初步获得有活性的人内毒素结合肽EBP。我们在体外细胞活性评价的基础上,初步观察它在烧伤合并内毒素血症动物模型中对机体的保护作用,为今后进一步的临床应用奠定基础。主要研究内容及结果如下: 1.内毒素结合肽EBP基因的克隆及原核表达载体的构建 ⑴ 参照NH-LBP的cDNA序列,针对其LPS特异结合区域,根据引物设计原则并按构建生物素融合蛋白表达载体的要求,设计一对引物。上游引物中含有HindⅢ识别位点,下游引物中含有两个原核细胞偏性密码子,外设BamHⅠ识别位点。 ⑵ 以含NH-LBP全长cDNA的质粒为模板,进行PCR扩增,得到93bp的EBP基因片段,2%的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明PCR扩增产物特异性较好,无杂带;利用DNA片段快速回收试剂盒进行回收。 ⑶ 以限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ消化回收的93bp PCR产物并与相同限制性内切酶处理的PinpointXa-3载体进行连接,构建PinpointXa3-EBP表达载体。 ⑷ 将表达载体转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,酶切分析获得阳性重组 WP=10 子; DNA序列分析结果表明PCR扩增产物符合设计要求,阅读框架正确,无移码和错码。 ⑸ 将阳性重组子转入大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导重组EBP融合蛋白的表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定结果显示:有与预期分子量大小相符的融合蛋白表达。确定了最适的表达条件为:用0.1mmol/L IPTG,37℃,诱导时间为4~5h。蛋白表达鉴定结果EBP融合蛋白主要以包涵体形式产生。利用Quntityone软件分析结果表明,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的33% 。 2.内毒素结合肽EBP的分离、纯化及生物学活性鉴定 ⑴ 大量表达并分离EBP融合蛋白包涵体,用8mol/L尿素溶解。采用SoftlinkTM Release Avidin Resin亲和层析法纯化表达的融合蛋白EBP。 ⑵ 用Xa因子裂解融合蛋白,将融合蛋白的裂解产物应用Sephdex G-25介质进行凝胶过滤层析;将凝胶过滤层析后收集到的目的蛋白用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化,收集目的蛋白主峰;再经RP-HPLC测样品纯度大于 99%;进行N末端氨基酸序列测定。 结果表明目的蛋白N末端10个氨基酸残基序列与预期序列完全一致。 ⑶ 采用谷胱甘肽氧化/还原系统对纯化后的目的蛋白进行复性;复性浓缩后的目的蛋白EBP含量为1.28mg/ml。获得的目的蛋白的总量约为13mg。 ⑷ 培养人单核细胞U937,应用FITC-LPS 与人U937细胞共同孵育,分别在孵育前后加入不同浓度上述纯化的EBP,经流式细胞仪观察U937细胞表面荧光结合的强弱,结果显示随着加入EBP浓度的增加,U937细胞表面的荧光强度逐渐减弱,说明EBP部分中和了结合在U937细胞表面的荧光物质标记的LPS。 ⑸ 采用U937细胞,设理对照组、LPS刺激组和LPS刺激+EBP作用组。ELISA法检测不同浓度EBP对LPS诱导的U937细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF()、白介素6(IL-6)的影响,结果表明EBP在不同浓度下对LPS诱导的U937细胞分泌TNF(、IL-6有抑制作用,且有明显的量效关系。同时检测了同一EBP浓度在不同作用时间U937细胞分泌IL-6、TNF(的变化。结果显示,加入了EBP的细胞在各时相点TNF(、IL-6的产生量均低于LPS作用组,说明EBP显著地抑制了LPS的作用,经纯化复性的内毒素结合肽EBP表现出较好的生物学活性。 3.内毒素结合肽EBP在烧伤合并内毒素血症大鼠模型中的保护作用观察 ⑴ 选用健康清洁级Wister大鼠78只,分为模型组、治疗组及对照组。按照本所成熟的方法建立烧伤合并内毒素血症大鼠模型,治疗组腹腔内注射注入400μg/kg制备好的内毒素结合肽;分别在处理后1、3、6、12、24、48h取血和肺、肝、肾组织。 ⑵ ELISA法检测大鼠血清TNF(、IL-6含量,结果表明:和模型组相比,治疗组 WP=11 在各时相点TNF( 、IL-6的含量均有不同程度的下降,提示EBP可能抑制了LPS的作用,从而减少了TNF(、IL-6等相关炎性细胞因子和介质的释放。 ⑶ 检
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

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