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《第三军医大学》 2003年
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人源轮状病毒的转基因马铃薯口服疫苗研究

李晋涛  
【摘要】: 人源轮状病毒(human rotavirus, HRV)是导致引起5岁以下婴幼儿急性腹泻和死亡的重要病原体,占所有肠道感染病因的50%以上。据估计每年全球约有近百万儿童死于HRV腹泻,发展中国家占87万,在我国初步的统计表明也有约10万。卫生措施似乎对HRV传播影响甚小,营养状况对发病危险的重要性也远低于细菌性腹泻。于是无论发达国家还是发展中国家,3岁前儿童90%都要受HRV感染。在美国,轮状病毒是住院、急诊室访视和门诊病人临床访视以及考虑卫生保健花费重点的常见病因,美国每年由此的医疗和间接开支逾10亿美元。轮状病毒腹泻在全球已成为一项重要的公共卫生问题,迄今尚无治疗RV的特效药物。世界卫生组织(WHO)对开发其疫苗给予高度重视。发展轮状病毒疫苗,预防病毒性腹泻是刻不容缓的任务。 近年来轮状病毒疫苗的研究策略有两种途径:一种是研制减毒活疫苗,另一种是亚单位疫苗。前者是用G1~G4型病毒共同感染培养细胞,在一定选择压力下挑选出合适的疫苗候选株。目前仅有美国(1998年)和我国(2000年)获准用于临床。但其活疫苗的稳定性以及由于病毒毒力回复带来的安全性问题是减毒活疫苗面临的本质上的缺陷,如美国的恒河猴轮状病毒疫苗(RRV)就因健康儿童接种该疫苗后屡屡出现肠套叠问题而禁用。如何保证其安全性其问题的关键。亚单位疫苗的研制策略是运用基因工程方法进行轮状病毒重组多肽疫苗的研究,目前尚没有成功的先例。 植物基因转化技术的发展和完善为上述问题的解决提供了途径。与传统的疫苗表达系统如细菌系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统相比,植物表达系统生产疫苗有以下的优点: 1) 植物细胞和动物细胞一样,均有着一套完善的真核表达系统。不同于动物细胞的是植物的组织(如叶、花、果实等)、细胞、原生质体均能在离体条件下诱导再生成一个完整的植株。而且植物细胞培养、植株种植条件简单易成活,一旦获得高效表达的转基因植株,就可以在短短的时间内大量繁殖出具有相同遗传背景的无性繁殖系,只需增加耕种面积,就能迅速形成产业化规模。故其成本较其他疫苗低得多。2)植物表达系统生产的蛋白质疫苗可进行正确加工,包括糖基化、磷酸化、酰胺化等,保持了自然状态下的免疫原性。而目前医药生产常用的微生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后加工,导致其免疫原性通常较弱。植物细胞具有“生物包囊”作用,可通过口服方式有效诱导免疫应答。3)动物细胞生产基因工程疫苗,常用 WP=12 动物病毒作为载体导入抗原基因;此外,生产过程中也可能污染动物病毒,这些病毒对人类具有潜在的危害性。转基因植物生产的疫苗不会感染人体,因而更具有安全性。4)粘膜免疫是病毒性腹泻的免疫保护机制,但在启动粘膜免疫方面尚属难题。转基因植物细胞是可以启动粘膜免疫的有效途径。其机制可能是植物细胞壁给抗原提供了一种生物微囊,后者可保护抗原不被消化道酶所降解,并有缓释作用。5)和传统疫苗不同,植物表达系统生产的疫苗可以直接储存在植物种子和果实中,无需冷连系统设备进行储藏运输,故易于长距离运输和普及推广。 迄今为止,已有多种病毒性抗原在在转基因植物中得到表达,直接口服免疫动物试验证明具有良好的免疫原性,尤其可以诱导产生抗原特异性IgA,启动粘膜免疫。但是,关于人源轮状病毒抗原基因的转基因植物轮状疫苗研究尚无报道,仅有两例关于鼠源NSP4基因CTL表位和牛源VP6基因的转基因植物疫苗的报道。本研究选择人源轮状病毒VP7基因作为靶基因进行转基因马铃薯口服疫苗研究,主要基于以下理由:第一,已有的研究表明,人源轮状病毒的外壳蛋白VP7是主要中和性抗原,在诱导机体产生体液和粘膜免疫应答、产生保护性免疫方面起决定性作用。早在1985年,Hoshino等人发现VP7是主要中和性抗原,随后的重组轮状病毒活疫苗正是基于这一点,选择VP7被人源轮状病毒替换的重配株,均具有较好的保护力。1990年和1992年,Anderew等人证实经过改造的VP7基因在重组痘苗病毒中表达,具有与相同感染滴度的SA11活病毒相当。而且其保护性免疫力可遗传给下一代幼鼠。Wang等人1999年将猪源轮状病毒VP7基因改造后在大肠杆菌中表达,也具有很好的中和病毒能力,何金生等人2001年以腺病毒表达人源轮状病毒VP7免疫小鼠,产生较强的体液和粘膜免疫应答,次年彭世勇等人用pCI分别进行VP7、VP4和VP6基因的DNA疫苗研究,结果仅VP7诱导最强的免疫应答。第二,VP7基因是高度保守的,在相同血清型其同源性可高达94-99%,不同血清型其同源性也可高达67-85%。第三,VP7是一种糖蛋白,对人体不致病,因而以此作为抗原对人体是安全的。第四,转基因马铃薯疫苗直接口服可在体诱导体液和粘膜免疫应答。因此,用人源轮状病毒VP7基因作为抗原基因研制可食性疫苗具有重要意义,可能代表着一种安全、高效的抗腹泻RV疫苗研制策略。本研究以HRV的VP7基因为靶基因进行转基因马铃薯疫苗研究,建立了适于马铃薯品种“台湾红”转化的植物转基因体系,获得表达VP7基因的转基因马铃薯,在一系列分子生物学鉴定的基础上,进行了动物试验证明了VP7在马铃薯中的表达具有免疫原性,在动物血清中检测到滴度为600的IgG?
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392

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【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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