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《第三军医大学》 2003年
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电离辐射致肠上皮损伤与修复相关蛋白的研究

章波  
【摘要】: 肠上皮是实现肠道消化、免疫、内分泌等功能的主要组织细胞,也是构筑肠道粘膜屏障的主要成分,同时它对辐射敏感。作为腹腔恶性肿瘤治疗主要手段之一,电离辐射对正常小肠上皮细胞具有毒副作用,限制了其在治疗上的应用。超过一定剂量照射可形成的肠型放射病,导致病死率极高,故对辐射诱导的小肠上皮损伤的研究受到极大的关注。 为深入阐明电离辐射致肠上皮损伤的分子机制,寻找促进肠上皮损伤修复和具有辐射保护作用的蛋白质,本研究以离体培养的IEC-6细胞(正常大鼠空肠上皮细胞)和小鼠9Gyγ-射线全身照射所致肠型放射病为模型,采用双向电泳技术分别比较了IEC-6细胞和小鼠小肠上皮细胞照射前后蛋白质表达的差异,通过MALDI-TOF-MS鉴定双向电泳图谱上差异的蛋白质点,采用Western blot和RT-PCR技术进行了部分验证,并集中研究了两个差异蛋白质PrxI和ERP29在电离辐射中的作用。取得了如下的主要结果: 一、 损伤模型的确定 利用IEC-6细胞作为体外研究模型是合理可行的。首先根据IEC-6细胞在不同照射剂量照射(15-35Gy)和照射后不同时相(1-3d)细胞增殖以及细胞凋亡量来确定合适的照射剂量。结果显示:利用25Gy照射后1天的细胞来研究细胞对电离辐射的反应是较为适合的。体内研究是以肠型放射病为模型。采用不同剂量的γ-射线(7-10Gy)全身照射小鼠,复制肠型放射病模型。结果表明:9Gy照射可导致小鼠出现典型的肠型放射病。9Gy照射3h后,小肠上皮隐窝高度和绒毛高度未见明显缩短,但细胞核分裂相消失,呈严重的损伤性改变;照射后72h,绒毛明显缩短,隐窝明显增高,表明有大量再生上皮细胞,以增殖修复为主。因此,该条件下小鼠能存活一定时间,其早期辐射损伤严重,后期修复明显,是较为适合的研究模型。利用含尿素的细胞裂解液能够较为完全地提取细胞的总蛋白,适合双向电泳制备蛋白样品的要求。 二、 IEC-6细胞照射前后蛋白质表达谱的差异 采用宽pH范围3-10L的干胶条(IPG、18cm),上样量为500-1000(g,聚焦6-8h,千伏时不低于32000。各选取3张照射前后的蛋白图谱,应用PDQUEST软件进行图像分析,在pH3-10L和Mr 14000-97400Da范围内检测蛋白。电泳图像经过PDQuest处理后,结果表明:在正常IEC-6细胞中检测到608±40个蛋白点,细胞照射后的样 WP=9 品中检测到595±31个蛋白点,其中匹配的蛋白点为396个,电泳图谱的相关系数为0.78。然后,选择了部分差异明显的蛋白点进行肽质量指纹图谱鉴定。在未匹配的蛋白点中选择清晰、较浓的点做好标记,从凝胶上准确切割后进行脱色、酶解、肽片段提取,并测定肽质量指纹图谱。根据质谱图中的肽片段质量进行检索,再结合双向电泳中蛋白点的表观分子量、等电点进行综合分析。本实验共对16个蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,其中11个蛋白点得到相应的蛋白质,这包括一些与代谢、自由基清除、细胞骨架相关的蛋白。其中,电离辐射后降低的蛋白质包括:STRESS-70 PROTEIN,Tubulin beta-5 chain,ATP SYNTHASE BETA CHAIN,Vimentin,PDZ and LIM domain protein 1等;而PEROXIREDOXIN 1,ERP29,Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,RGS4,Aldehyde dehydro- genase(mitochondrial precursor)等在照射后升高。在此基础上,对其中部分蛋白质进行了验证。Western blot结果显示:STRESS-70 PROTEIN在照射后确实被降低了。RT-PCR结果显示:ERP29基因在照射后基因表达增高,这与其蛋白质在照射后升高相吻合。 三、 小鼠全身照射前后小肠上皮细胞蛋白质表达谱的差异 在9Gy的剂量照射后,分离小肠上皮细胞,并采用Percoil细胞分离液对上皮细胞进行了纯化,得到相对较为单纯的肠上皮细胞。利用含尿素的细胞裂解液提取细胞的总蛋白,对同一样品进行多次电泳。总蛋白的分布模式非常相似:蛋白质斑点相对集中于pH4~7,极端酸性蛋白与碱性蛋白数量较少;蛋白质相对分子质量集中于(15~100)×103,超出此范围的斑点较少。采用PDQuest软件比较各组图谱,在正常对照组、照射后3h组以及照射后72h组分别检测到638±39、566±32和591±29个蛋白质点,总蛋白质点在照射后有所减少。照射后3h组与正常对照组相比有360个点相匹配,电泳图谱的平均相关系数为0.78;照射后72h组与正常对照组相比有312个点相匹配,电泳图谱的平均相关系数为0.82;照后3h组与照后72h组相比有282个相匹配,电泳图谱的平均相关系数为0.76。不匹配的斑点主要为低丰度蛋白质。在差异的蛋白点中选择清晰、较浓的点做好标记,从凝胶上准确切割后进行脱色、酶解、肽片段的提取,并测定肽质量指纹图谱。根据肽质量指纹图中肽片段的质量数进行检索,再结合蛋白质点的表观分子量、进行综合分析。共对28个蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,19个蛋白点得到相应的蛋白质,这包括一些与代谢、过氧化应急、信号转导相关的蛋白。其中,电离辐射后降低的蛋白质包括:Transforming protein RhoB,Antioxidant Protein 2,Q8VC72,O70619等;而PEROXI- REDOXIN 1,ERP29,Rho GDP-dissociation inhibitor 1,Alpha enolase,Prolactin receptor precursor,Glutathione S-transferase P2,Truncated
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R363

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【参考文献】
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