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《第三军医大学》 2003年
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三羟异黄酮对HER-2/neu高表达乳腺癌血管生成的影响及其机理研究

余小平  
【摘要】: 肿瘤血管生成在肿瘤生长和转移过程中发挥着重要作用。20世纪70年代Folkman等人首先发现实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成,并受血管生成促进因子和抑制因子的双重调节,因此设想通过抑制血管生成便可抑制肿瘤的生长。促进肿瘤血管形成的因素主要有两个方面:一是肿瘤内血管内皮细胞的增殖;二是肿瘤组织细胞以及血管内皮细胞分泌的促血管形成相关因子。在乳腺癌中促血管形成相关因子主要有血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(urokinase type plasminogen activator,uPA)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9),这些因子能有效促进血管内皮细胞(endothelium cell,EC)的增殖分裂,破坏由基底膜和细胞外基质构成的组织屏障,从而允许血管内皮细胞迁移。已有研究发现,乳腺癌组织微血管密度(microvessel density,MVD)与MMP-2、MMP-9 、uPA和VEGF的表达呈正相关,提示MMP-2,MMP-9、uPA和VEGF可能是影响乳腺癌血管形成能力的重要因素。 蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性型膜受体HER-2/neu高表达乳腺癌血管形成能力较强,恶性程度较高。已有研究证实乳腺癌细胞MMP-2、MMP-9和uPA的表达调节依赖于PTK信号转导通路,抑制PTK活性可降低MMP-2、MMP-9和uPA的表达和分泌。HER-2/neu抗体处理HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞,可引起剂量依赖性的VEGF表达下降。提示促乳腺癌血管形成相关因子MMP-2,MMP-9、uPA和VEGF的表达调节可能与细胞膜受体PTK活性有关。 三羟异黄酮(genistein,又称染料木黄酮或金雀异黄素)是大豆中的一种重要非营养素成分,具有较强抗癌效应。已有研究发现genistein部分抗癌机制包括:抗雌激素作用;抑制PTK活性;抗氧化及提高机体免疫力等。另有研究发现genistein能通过抑制肿瘤血管形成的间接效应而抗膀胱癌和前列腺癌的生长。Genistein是一种天然强力高效的PTK活性抑制剂,我们推测genistein一方面可能通过抑制膜受体HER-2/neu的PTK活性,下调乳腺癌细胞促血管形成相关因子MMP-2、MMP-9、uPA、VEGF的表达;另一方面抑制血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的PTK活性,降低血管内皮细胞丝裂原活化蛋白激酶 WP=11 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)活性,抑制血管内皮增殖。Genistein可能通过这两条途径抑制HER-2/neu高表达乳腺癌新生血管形成。 基于以上分析,结合国内外研究进展,本研究首先利用裸鼠乳腺癌异种移植瘤动物模型,采用基因转染和免疫组化技术等方法,观察genistein对HER-2/neu高表达乳腺癌细胞移植瘤内肿瘤细胞生长能力和移植瘤内微血管密度的影响;然后体外利用雌激素受体表达阴性(negative estrogen receptor,ER-)的乳腺癌细胞MDA-MB-453和雌激素受体表达阳性(ER+)的MCF-7细胞为对象,应用western blot、RT-PCR、免疫沉淀、免疫细胞化学以及激酶活性分析等技术,探讨genistein影响 HER-2/neu高表达乳腺癌血管生成与MMP-2、MMP-9、uPA和VEGF表达水平及PTK活性的关系;最后以脐静脉内皮细胞ECV304为研究对象,通过绘制细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞仪分析、激酶活性分析以及免疫细胞化学等方法,观察genistein对VEGF促血管内皮细胞ECV304增殖的影响及其与VEGFR和MAPK活性的关系。 主要研究结果和结论如下: 1. 含人erbB-2/neu基因的pCMV/ERBB2质粒和空载体pCIneo质粒共转染MCF-7乳腺癌细胞(命名为MCF-7/HER-2)后,成功建立HER-2/neu高表达乳腺癌异种移植瘤模型,经genistein和HER-2/neu抗体处理后发现,免疫缺陷裸小鼠(BALB/c)分别接种MCF-7、MCF-7/HER-2细胞后均能长出肿瘤,成瘤率为100%,MCF-7细胞移植瘤体积较小(0.18±0.08 cm3),癌细胞生长能力较弱,移植瘤内MVD(16±6个)和VEGF、MMP-2、MMP-9、uPA的表达水平较低,而MCF-7/HER-2细胞移植瘤体积较大(1.25±0.35 cm3),癌细胞生长能力较强,移植瘤内MVD较高(98±21个),VEGF、MMP-2、MMP-9、uPA的表达水平升高,HER-2/neu抗体和genistein处理的MCF-7/HER-2细胞移植瘤体积比未经药物处理的MCF-7/HER-2细胞移植瘤体积小(p0.01),癌细胞生长能力减弱,移植瘤内MVD降低(分别为56±18和52±19个,p0.01),VEGF、MMP-2、MMP-9、uPA的表达下调,HER-2/neu抗体处理组和genistein处理组之间肿瘤体积大小和MVD差异不显著(p0.05)。说明erbB-2/neu基因与乳腺癌VEGF、MMP-2、MMP-9、uPA的表达上调有关,能促进乳腺癌血管生成,而genistein和HER-2/neu抗体均能有效抑制HER-2/neu高表达乳腺癌移植瘤的生长,降低肿瘤内微血管密度。 2.pCMV/ERBB2质粒和pCIneo质粒共转染入乳腺癌MCF-7细胞(MCF-7/HER-2)后,应用免疫沉淀、激酶活性分析、RT-PCR等技术分析表明,MCF-7/HER-2细胞与MCF-7细胞相比膜受体HER-2/neu蛋白磷酸化水平升高,PTK活性增加(0.570pmol/min/μl增至1.252 pmol/min/μl,p0.01),促血管生成相关因子VEGF、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA水平和蛋白表达上调。提示原癌基因erbB-2/neu能通过增加膜受体HER-2/neu的
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R737.9

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