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大鼠骨髓间充质干细胞来源心室肌样活细胞的体外诱导及其特异标记的研究

陈勇  
【摘要】: 随着抗凝剂、β-受体阻滞剂,血管紧张素转换酶抑制剂,血运重建和心脏移植的应用,心肌梗塞的病死率有所下降,但仍是导致冠心病死亡的最主要原因之一。由于成人心肌细胞自身再生能力有限,梗死的心肌细胞虽可被疤痕组织取代,但心脏的收缩功能无法恢复,心功能因此受到影响,最终导致心脏功能衰竭。细胞性心肌成形术(cellular cardiomyoplasty, CCM)不但能够增加心肌细胞的数量,而且增加的心肌细胞具有收缩功能,实现心肌细胞的结构修复和功能恢复,因而被认为是目前降低心肌梗塞患者病死率较有前景的治疗手段之一。 CCM成功的关键是选择合适的“种子”细胞。在以往的研究中,科学家们将胚胎细胞、平滑肌、骨骼肌及其前体细胞应用于CCM,应用这些手段可改善部分患者的心脏结构和功能,但由于这些“种子”细胞均来源于异体,存在免疫排斥等问题,同时医学伦理问题也阻碍着这些“种子”细胞应用于CCM。近年来的研究表明,来源于自身的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可在体外大量扩增,且具有多向分化潜能,能在适当的微环境中,分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、内皮、平滑肌、骨骼肌细胞和心肌样细胞。骨髓MSCs的应用由于没有医学伦理和免疫排斥等问题,可能成为自体细胞移植(包括CCM)的细胞来源,或作为基因治疗的理想载体。 MSCs应用于CCM是以其能在体外大量增殖,并可分化为能取代受损心肌的心肌样细胞为基础。虽然骨髓MSCs向心肌样细胞分化的具体机制目前仍然不清楚,但大量的研究支持MSCs能分化为心肌样细胞,并与宿主细胞形成闰盘。心肌梗死主要发生于心室,CCM的理想“种子”细胞理所当然主要是心室肌细胞。然而,在诱导骨髓MSCs分化的过程中,MSCs分化为心肌样细胞的比例低,分化的细胞混杂。因此,如何提高MSCs分化为心肌样细胞的效率和从混杂的细胞中获取MSCs来源的心肌样细胞是目前骨髓MSCs应用于CCM急待解决的关键问题。文献报道,增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标记的细胞可以应用常规的荧光激活的流式细胞分选技术从混杂的细胞中分离出来,肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)-2v启动子驱动的报告基因特异表达于心室肌细胞。 基于以上考虑,本课题以成年Wistar大鼠骨髓MSCs为研究对象,着重探讨了骨髓MSCs在5-氮胞苷诱导下向心室肌样细胞分化的可行性及其可能机理,利用心 WP=10 室肌特异的 MLC-2v启动子驱动的EGFP特异标记了骨髓MSCs分化的心室肌样细胞,为进一步筛选和研究骨髓MSCs来源心室肌样活细胞奠定了基础。 主要研究内容及结果如下: 一、成年大鼠骨髓MSCs的分离及培养 利用Percoll梯度密度离心的方法从成年Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓中分离培养MSCs出单个核细胞,结合贴壁培养的方法,分离纯化MSCs。单个核细胞培养于由IMDM培养液,10%特等优质胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和青霉素100 u/ml、链霉素100μg/ml组成的完全培养基,首次于接种后24h换液,以后每3d换一次液。在相差显微镜下观察到:接种到培养瓶的原代细胞,除了单个核细胞外,还有少量红细胞,在接种后4小时开始有细胞贴壁,24小时后明显贴壁,3-4天可见一些小集落形成,7-10天后集落迅速增多,12-16天后逐渐融合成片,细胞融合达80%-90%;原代培养的细胞较混杂,MSCs的形态大部分为梭形的成纤维细胞状,扁平状的细胞为其他基质细胞;随着换液次数的增加,悬浮的造血细胞逐渐减少,梭形的成纤维细胞状细胞逐渐增多;细胞融合达70-80%时,以1:2-3比例传代后的MSCs的贴壁能力非常强,P1 MSCs在接种后4h贴壁的细胞就达60%,到12h后可至90%,一般6-9天后便可再次传代。随着传代次数增加,扁平宽大的细胞也增多,MSCs趋于老化。有趣的是,始终可见少量透亮的小而圆形的细胞,除了为粘附的造血干细胞外,也可能是未定向的R-S细胞。从MSCs的生长曲线看,原代MSCs在接种后1-4天进入静止生长期,第5-10天生长迅速,进入指数生长期,11-14天进入平台生长期。传代的MSCs的生长特点与P0 MSCs相似,但生长能力有逐渐下降的趋势,静止生长期缩短至1-3天,对数生长期缩短至3-4天,传代增加,趋势越明显。在我们的培养条件下,倍增约25次时,细胞几乎停止生长。 二、5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓MSCs向心室肌样细胞分化的研究 为了诱导骨髓MSCs分化,将融合至70-80% P1代MSCs置入诱导培养基(IMDM,3%马血清,4%优质胎牛血清,10μM 5-氮胞苷,100 u/ml青霉素,100μg/m链霉素) 中,24h后更换为完全培养基,每3天换一次液。为了鉴定5-氮胞苷诱导分化的大鼠骨髓MSCs中是否含有包括心室肌样细胞在内的心肌样细胞,进行了形态学观察和分子标志的检测。相差显微镜下观察到:在5-氮胞苷(10μM) 诱导后1-3w,少量成纤维细胞样的MSCs逐渐变长和变宽大,转变为具有肌管形成细胞形态特点的杆状或球状,椭圆形单核或多核细胞,到第4-6w部分细胞与周围细胞聚在一起。RT-PCR、免疫组化或Western Blot进一步检测到,胚胎型心肌特有的actin-α和心室肌特有的MLC-2v结构蛋白,功能性受体β1-肾上腺素受体(β1-AR),β2-AR和心肌细胞分化相关转录因子NKx2.5/csx,GATA4,MEF-2D在


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