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《第三军医大学》 2003年
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兔实验性慢性高眼压视网膜损害相关基因的克隆及筛选

王秀青  
【摘要】: 目的:通过建立兔慢性高眼压模型,获取兔慢性高眼压及对照眼视网膜组织,利用抑制性消减杂交技术分析视网膜组织表达差异基因并构建差减文库,通过筛选及生物信息学分析获得与慢性高眼压视网膜损害相关的基因表达片段。 方法:本实验分以下两部分进行: 实验一 慢性高眼压动物模型的构建及其形态学观察 通过甲基纤维素注入兔眼前房的方法建立兔高眼压模型,对照眼注入等量的平衡盐溶液,每周注入一次,共5周,保证实验眼眼压在25-35mmHg。5周后取视网膜及视神经组织进行组织学观察,确定慢性高眼压模型成功。 实验二 兔慢性高眼压视网膜组织差异表达基因的克隆与筛选 1. 提取慢性高眼压组和对照组视网膜组织总RNA; 2. mRNA纯化; 3. 消减杂交; 4. 用PMD18-T载体构建消减文库; 5. 斑点杂交筛选,确定高眼压相关基因片段; 6. 选择性测序及分析; 7. 原位杂交进行高眼压视网膜损害相关基因片段的细胞定位。 结果:眼压测量发现实验眼眼压保持在25-35mmHg,时间持续5周。光镜下RGC明显减少,神经纤维层变薄,视神经纤维密度明显减少,电镜观察发现RGC核固缩、核仁边集;线粒体肿胀,内质网扩张,胞浆空泡样变性;内核层细胞核固缩,核周间隙扩大;外核层部分染色质浓缩,与慢性青光眼的病理变化相同。 视网膜总RNA电泳及分光光度计测量分析无污染、降解。mRNA纯化后电泳及分光光度计鉴定符合进一步实验的要求。消减效率分析消减效果较好,证明cDNA合成、RsaⅠ酶消化、接头连接、消减杂交、PCR扩增过程成功。 构建差减文库和斑点杂交筛选后,正向消减发现28个阳性克隆,反向消减发现90个克隆。将此结果进行斑点杂交,筛选出有明显差异的正向消减11个克隆,反向消减30个克隆,它们分别带有兔眼慢性高眼压后视网膜组织上调和下调的基因片段。 将此41个克隆根据差异的显著性选择19个片段进行测序,得到有效序列16个, WP=8 将这些序列在NCBI-BLAST中比对发现其中2个为未知基因片段,2个为已知基因片段(相似性高于90%)。其中一个已知基因片段(编号F9)与Rap和Rab家族基因相似性高达99%。将F9片段标记生物素作为探针进行视网膜组织ISH,确定其大量表达于实验组视网膜组织中的神经节细胞及内核层细胞,而对照组视网膜组织不表达。 结论:本实验使用的慢性高眼压动物模型,可产生与慢性青光眼损害相同的病理改变;利用抑制性消减杂交技术筛选到一批与慢性高眼压视网膜损害相关的基因,选择性测序发现2个未知EST片段和2个已知EST片段,证明在慢性高眼压下视网膜基因表达平衡失调,这些是视网膜损害的原因之一;与Ras基因相似率达99%的已知EST片段F9广泛存在于慢性高眼压5周后的兔视网膜中,说明该基因片段在慢性高眼压视网膜损害中具有重要的作用,该基因及其它相关基因的功能和相互作用有待进一步研究。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R775

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