收藏本站
《第三军医大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片的研制

鲁卫平  
【摘要】: 从分子生物学水平上研究生物大分子,是微生物检测发展的趋势。这种以微生物的基因为检测靶标的检测方法,既能够克服以微生物表型特征为基础检测方法的缺点和影响因素,从根本上对微生物进行鉴别和特征分型,同时能够大大缩短检测时间,提高检测灵敏度和特异性。基因芯片技术是近年来发展起来的一项新的核酸检测实验技术,具有快速、敏感、高效、高通量等优点,已逐渐应用于DNA测序、基因表达谱分析、基因多态性分析、药物开发、基因诊断等多个领域。但目前的病原体检测芯片,在探针设计上,多采用病原体特异性基因片段为探针,虽然特异性强,但各探针序列长、结构复杂,Tm值、GC含量、长度差异大,很难保证芯片上所有的探针分子能在相同条件下充分杂交,使芯片可靠性降低。在分子标记上,多采用荧光素为报告分子,灵敏度低,检测条件高,数据的读取与分析需要昂贵的仪器设备。因此目前的病原体检测芯片检测内容单一,目标菌数量较少,操作复杂,设备要求高,难以在临床广泛应用。本研究针对目前临床检测用基因芯片的主要缺点,采用寡核苷酸探针和纳米金信号放大技术,研究能快速、准确地检测和鉴定病原体的高通量的、操作简便、适合临床使用的基因芯片检测技术。实验主要分为两部分,首先通过文献检索和临床调查,把临床上常见的一些感染病原体以及一些临床少见但非常重要的病原体作为检测目标,比较选择经验证并得到公认的各病原体种、型保守基因片段作为其特征性核酸标志,用于各病原体的检测和鉴定。设计、筛选出特异性寡核苷酸探针,并制成膜芯片用于样品的检测以验证其可靠性。然后,选用醛基修饰的玻片为载体,氨基修饰探针制作芯片。通过检测不同探针浓度对探针固定效率及杂交效率的的影响,确定最佳点样浓度。建立了纳米金核酸标记方法和杂交信号银染放大检测方法。并将该芯片检测技术用于临床样品的检测,确定其临床实用性及可靠性。 实验的主要方法及结果如下: 1. 通过查阅文献报道并进行临床调查,确定20余种临床常见的感染病原体以及一些临床少见但非常重要的病原体为检测目标,包括细菌、病毒、真菌及耐药基因。完成了各靶病原体特征性核酸标志的确定以及扩增引物的设计。 完成了12个病原体及一个耐药基因PCR扩增方法,包括:金黄色葡萄球菌、 WP=8 2. 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、乙肝病毒、丙肝病毒以及mecA基因等,并对扩增条件进行优化,使各扩增反应能在相同的扩增条件下完成。 3. 在相同条件下设计了各靶病原体特异性寡核苷酸探针,利用生物信息学方法对探针进行计算机模拟筛选,并利用同位素标记靶序列对探针的特异性、可靠性的指标进行检测,并确定了杂交条件。结果显示探针间Tm值相差仅0.4℃,各探针在G+C含量、发夹结构、自身二聚体以及重复碱基数等指标均符合寡核苷酸探针设计要求,所选用探针特异性强,具有相同的杂交条件。 4. 将筛选出的检测探针、阳性对照探针以及阴性探针点在尼龙膜上制成膜芯片,用于样品的检测,相应检测探针点及阳性对照均有杂交结果,阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果,背景清晰,结果可靠。证明本检测方法准确可靠,可用于各靶序列的检测。 5. 为确定最佳点样探针浓度,进行了探针浓度对探针固定效率和杂交效率的影响研究。结果探针浓度从5nM到4000nM变化时,其固定效率先迅速增加,在浓度达到1500nM后趋于平缓。与靶序列杂交后其杂交点信号强度值在高于1500nM的探针高浓度区,反而呈下降趋势。表明点样探针浓度为1500nM时可获得较好的固定率和杂交效率,因此将制备芯片的探针浓度确定为1500nM。 6. 实验结果显示,用纳米金标记样品同芯片杂交,银染显色,其最低检测值可达100fM,同目前常用的cy3为报告分子的方法相比,其灵敏度要高出50倍,且检测结果可以用肉眼或普通光学仪器记录。 7. 临床样品的检测结果显示,阳性探针点及阳性对照点均有显色结果,阴性对照、空白对照和其他探针点均无显影结果,背景清晰,结果可靠。检测结果与常规经典检测鉴定方法结果一致,证明本检测方法准确可靠,可用于临床样品的检测。 以上实验结果表明:该芯片检测技术灵敏度高,特异性好,不需要特殊设备,操作方法简单,能部分满足临床检测的通量要求,具有很好的临床应用前景。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 金钢,应康,景在平;基因芯片在肿瘤研究中的应用[J];第二军医大学学报;2000年09期
2 万群,吴洁,宋明;表达谱基因芯片及其在植物研究中的作用[J];四川农业科技;2004年04期
3 毛红菊,金根娣,刘康栋,赵建龙,陆志檬;基因芯片在丙型肝炎病毒分型检测中的评价[J];现代免疫学;2005年01期
4 倪秀珍,刘海音,辛树权;生物芯片技术及产业化[J];长春师范学院学报;2002年02期
5 徐秋林,马文丽,李凌,石嵘,郑文岭;一种新的基因芯片检测荧光标记技术:通用引物U_2联合标记法[J];第一军医大学学报;2005年03期
6 吴斌,林乔,王米渠,王建国;试论影响基因芯片实验设计的因素[J];世界华人消化杂志;2005年10期
7 刘炎,顾晓松;基因芯片技术进展及应用[J];南通医学院学报;2000年04期
8 孙啸,王晔,何农跃,赵雨杰,陆祖宏;生物信息学在基因芯片中的应用[J];生物物理学报;2001年01期
9 魏芳,赵新生;基因芯片检测技术的一些进展[J];大学化学;2003年05期
10 陆巍,王翼飞;基因芯片的信息挖掘[J];上海大学学报(自然科学版);2003年03期
11 杨兰泽,高静;基因芯片技术及其医学应用前景[J];河南科技大学学报(医学版);2003年04期
12 郭刚;DNA芯片技术与SNP分析[J];国外医学.卫生学分册;2004年01期
13 徐建震,郭政,李霞,屠康,王辰光;基因芯片的功能评价与辅助设计软件GeneHubD[J];生物信息学;2004年03期
14 韩安家,熊敏;基因芯片技术及其在医学领域中的应用新进展[J];中国医学科学院学报;2001年05期
15 朱平;PCR基因芯片[J];北京大学学报(医学版);2002年05期
16 张润锋,陈宏;基因芯片及应用[J];黄牛杂志;2002年03期
17 翟新验,刘钧;基因芯片技术的应用前景[J];当代畜牧;2003年06期
18 杨晓春,高万荣,陶纯堪,卞松玲,胡茂海,丁胜;基因芯片共焦扫描仪的分辨率与信噪比[J];应用光学;2003年04期
19 二艳;;藏不住秘密的肉罐头[J];大科技(科学之迷);2004年07期
20 伍亚舟;易东;黄明辉;李辉智;;局部均值化方法在基因芯片标准化中的应用研究[J];中国卫生统计;2005年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 金旻;戚华兵;黄炜;王小凤;陈林;;基因芯片研究结合FGFR3的核心短肽对小鼠前软骨细胞的作用[A];中华医学会第六次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会成立十周年论文汇编[C];2011年
2 刘全海;;基因芯片和新药研制[A];中国药理学会第九届制药工业药理学术会议论文摘要汇编[C];2000年
3 王文勇;黄晓峰;闫庆国;王伯澐;;激光捕获显微切割技术应用研究新进展[A];中华医学会病理学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
4 裴军;;用基因芯片寻找差异表达基因[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
5 赖沛龙;杜欣;翁建宇;凌伟;吴穗晶;罗成伟;郭荣;陆泽生;;应用基因芯片筛选硬皮病样慢性移植物抗宿主病相关基因的初步研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
6 孙啸;谢建明;陆祖宏;;高密度基因芯片设计和信息分析[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
7 贾坤;罗长保;鱼海琼;赵吟;谢凯英;林志雄;李守军;;牛分支杆菌与结核分枝杆菌基因芯片检测探针的筛选[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
8 李轶博;于明;;相位保留小波去噪法及其在基因芯片图像中的应用[A];现代通信理论与信号处理进展——2003年通信理论与信号处理年会论文集[C];2003年
9 裴军;;基因芯片在毒理基因组学研究中的应用[A];中国毒理学会第三届全国学术会议论文(摘要)集[C];2001年
10 李红丽;杨忠;蔡文琴;Lawrence;李泽桂;;基因芯片筛选维甲酸(RA)诱导神经管缺陷相关基因的研究[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 季明 徐寿松;基因芯片亮相上海[N];新华每日电讯;2002年
2 记者 刘熙;省一院基因芯片诊断技术获卫生部认证[N];云南日报;2010年
3 南方日报记者 陈枫 通讯员 宋忠雷 彭文斌;省二医应急大楼:全省首家“移动医院” 省妇幼番禺新院:有了地贫基因芯片[N];南方日报;2011年
4 周向东;基因芯片:神奇的医生[N];中国医药报;2001年
5 林海慧;共建全国最大基因芯片基地[N];证券时报;2000年
6 记者 季洪光;基因芯片可望大规模临床应用[N];科技日报;2003年
7 记者 郑晓强 通讯员 陈海峰;全国首个遗传病基因芯片开放式检测平台在厦建成[N];福建日报;2009年
8 吕建强;深圳积极创新基因芯片检测方法[N];中国食品报;2010年
9 《金周刊》记者 朱杰;基因芯片:窥见巨额利润[N];中国经营报;2001年
10 ;应时而生前景灿烂[N];中国医药报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨林;猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用[D];中国农业大学;2005年
2 刘雪强;乌头碱逆转耐药性人口腔上皮鳞状癌细胞分子机制研究[D];北京中医药大学;2005年
3 周盛年;电刺激大鼠癫痫模型及基因芯片检测谷胱苷肽-巯-转移酶基因的表达[D];山东大学;2004年
4 许明火;表皮参与瘢痕形成的实验和临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
5 王珍祥;增生性瘢痕的基因芯片分析及意义[D];第三军医大学;2002年
6 祁震宇;人脑胶质瘤中二条差异表达基因的研究[D];苏州大学;2003年
7 刘学端;海底及污染环境中微生物群落分子多样性研究[D];湖南农业大学;2003年
8 孙波;基因芯片技术在子痫前期外周血白细胞差异表达基因研究中的初步应用[D];吉林大学;2006年
9 祁小飞;骨髓增生异常综合征患者的基因表达谱研究[D];苏州大学;2006年
10 金冲飞;伴晶状体脱位的Marfan综合症的候选基因突变筛查和特异性筛查基因芯片的初步设计及验证[D];浙江大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡明;人退变椎间盘基因表达谱的研究[D];第二军医大学;2004年
2 王玉鹏;基于基因芯片的基因表达模式分析[D];厦门大学;2007年
3 戴奇刚;鼻咽癌转移相关基因表达谱的研究[D];广西医科大学;2008年
4 朱利娜;酵母基因芯片的制备及其在热休克基因表达谱研究中的应用[D];第一军医大学;2002年
5 江远;基因芯片技术研究莪术不同成分对HSC-T6细胞基因表达的影响[D];湖北中医学院;2004年
6 宋光辉;应用基因芯片研究同型半胱氨酸对ECV-304细胞基因谱表达的影响[D];郑州大学;2004年
7 沈征;2型糖尿病大鼠建模、基因表达谱与细胞凋亡研究[D];浙江大学;2004年
8 林苗;2型糖尿病大鼠肝脏基因表达谱[D];福建医科大学;2004年
9 李秀萍;应用基因芯片检测奶牛乳房炎主要致病菌的研究[D];山东农业大学;2005年
10 赵文瑾;HBV基因分型芯片的构建及临床初步应用[D];中国医科大学;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978