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《第三军医大学》 2003年
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血管紧张素Ⅱ致肥大心肌细胞微管及Calcineurin通路变化的实验研究

陈红勤  
【摘要】: 目的:微管是细胞骨架系统的重要组成成分。近年来,因与心肌肥厚、心力衰竭关系密切而受到广泛的关注。目前,研究的重点主要围绕在微管作为机械刺激感受器而发挥作用的层面上。而一些重要的神经体液因子如血管紧张素Ⅱ能否通过某种途径介导微管重构有待进一步明确。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ致肥大心肌细胞微管及其组分的变化规律以及细胞骨架系统与心肌肥大重要信号转导通路Calcineurin通路的关系及骨架调控剂对该通路信号转导的影响。 材料与方法:1、应用分步消化法进行Wistar 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养,采用特异性免疫细胞化学染色方法鉴定所培养的心肌细胞。2、采用血管紧张素Ⅱ诱导建立肥大心肌细胞模型。应用[~3H]-亮氨酸掺入法检测心肌肥大及透射电镜观察肥大心肌细胞超微结构变化。3、应用免疫荧光法,激光共聚焦显微镜下观察血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中微管的空间重构及骨架调控剂对微管空间构象的影响。4、应用蛋白质免疫印迹法检测肥大心肌细胞中β-微管蛋白含量的变化及骨架调控剂对β-微管蛋白含量的影响。5、应用比色法,酶标仪检测肥大心肌细胞中CaN的活性及骨架调控剂对其活性的影响。 结果: 1、原代培养的心肌细胞呈梭形、三角形及不规则形。其中,梭形细胞占培养细胞的大多数,胞体呈细长的梭形,胞质折光性强,搏动明显。特异性小鼠抗大鼠α-心肌肌动蛋白免疫细胞化学染色,可见细胞浆中大量棕红色丝状阳性着色,胞核不着色。 2、与对照组比较,AngⅡ组超微结构改变表现为:心肌细胞胞核及核仁增大,胞核形态不规则,异染色质丰富,线粒体肿胀,细胞质中糖原及脂质沉着。这些改变符合代偿性细胞肥大表现。 3、AngⅡ组心肌细胞[~3H]-亮氨酸掺入较对照组明显增强,提示细胞肥大、蛋白质合成增强。在AngⅡ作用的基础上,微管解聚剂colchicine 可使细胞[~3H]-亮氨酸掺入明显减弱,而微管稳定剂taxol 可明显增强细胞[~3H]-亮氨酸掺入。 4、AngⅡ组心肌细胞中微管的荧光强度及密度增强,β-微管蛋白表达增加。在AngⅡ作用的基础上,colchicine导致微管的荧光强度及密度减弱,β-微管蛋白表达减少;而taxol 导致微管的荧光强度及密度增强,β-微管蛋白表达增加。 5、AngⅡ组心肌细胞CaN活性较对照组明显增强,应用骨架调控剂colchicine或 WP=7 taxol后,CaN活性分别减弱或增强。 结论: 1、采用胶原酶分步消化培养原代心肌细胞具有简便易行、细胞产量高、损伤小、活力及纯度高的优点,是研究心肌肥厚、心力衰竭以及高血压、冠心病的重要手段和工具。 2、AngⅡ可明显促进心肌细胞增生及结构蛋白的生物合成,进而导致细胞发生肥大病理改变。 3、AngⅡ可导致心肌细胞中微管的密度及稳定性增加,β-微管蛋白表达增强。 4、AngⅡ可引起微管的空间构象发生重排以对抗作用于心肌细胞的不利刺激;同时,作为一种信号转导装置,微管通过其聚合、解聚作用来调控细胞对不同外来刺激的反应及细胞的跨膜信号转导,在心肌肥大的过程中发挥着非常重要的作用。 5、骨架调控剂秋水仙素及紫杉醇通过与微管相结合,改变了微管的空间构象,进而调控细胞对不同外来刺激的反应及细胞的跨膜信号转导,在心肌肥大的过程中发挥着重要的调控作用。 6、微管通过其聚合、解聚作用影响细胞内钙调神经磷酸酶活性,进而影响细胞内钙的代谢。在AngⅡ诱导心肌肥大的过程中发挥着重要的信号转导作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R542.2

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