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《第三军医大学》 2003年
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PERV检测方法的建立及其在猪肝细胞型生物人工肝中安全性的初步研究

郭海涛  
【摘要】: 急性肝衰竭、暴发性肝衰竭和终末期慢性肝病目前的死亡率仍较高,其最有效的疗法是肝移植,但因供肝来源匮乏,很多患者在等待时死亡。故对这类疾病的生物治疗以起到过渡支持作用,如:生物人工肝等,逐渐成为研究热点之一。采用猪或转基因猪肝细胞已成为生物人工肝的主要细胞来源,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视。 PERV是一类C型逆转录病毒,在形态学和生化学上具有其它哺乳动物C型病毒的典型特征,病毒cDNA已整合于猪基因组,其mRNA在组织中亦呈现高表达。根据PERV囊膜env基因受体结合区的差异,可将其分为3种不同的类型:PERV-A、PERV-B和PERV-C。自Patience等首先发现PERV能够感染体外培养人胚肾293细胞系,已有研究证实PERV可感染人细胞系,如人T淋巴细胞系C8166、脾细胞系WIL2.NS.6TG、单核细胞系THP-1以及灵长目PBMC。从感染PERV的人细胞中分离出的病毒粒子其感染范围更加广泛,包括人二倍体纤维瘤细胞和T、B淋巴细胞系均可感染。此外,在有丝分裂原刺激下体外培养猪外周血单个核细胞(PBMC)、动脉内皮细胞、PK-15细胞等均可观察到病毒颗粒的释放。目前已建立了PERV感染的动物模型,但有关接受活猪组织或细胞移植的临床病例的报道均未发现PERV感染的确切证据,其在生物人工肝中安全性的问题亦需进一步研究。 本课题在体外两步法分离猪肝细胞的基础上,观察了中国实验小型猪PERV携带情况,对血清中病毒释放情况进行了检测,并以此初步建立了PERV的检测方法;在了解猪肝细胞不同培养方式下(普通培养、混合凝胶及生物反应器培养)细胞形态及功能的变化,发现在缺乏有丝分裂原刺激的情况下以及在生物人工肝常用的猪肝细胞培养模式下该病毒释放的一般规律;对已经使用猪肝细胞进行生物人工肝治疗的患者进行了回顾性检测,并对PERV对胎肝细胞的感染性进行了初步研究。上述研究采用的方法与结果如下: 1) 初步建立了猪内源性逆转录病毒检测的方法,在猪肝脏、血清等标本均可检测到病毒序列,而HBV、HCV阳性患者及其它动物的血清和肝脏标本的检测结果均为 WP=9 阴性,显示了较好的特异性。 2) 对普通培养、混合凝胶及生物反应器培养的猪肝细胞进行氯化铵代谢、猪白蛋白合成等实验结果表明,在培养的早期细胞能够维持较好的生物活性。发现在缺乏有丝分裂原的刺激下,培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡;在反应器培养的内腔及外腔亦可检测到病毒序列的存在。 3) PCR法和RT-PCR检测显示,含PERV的猪肝细胞培养上清未能感染胎肝细胞;同时,对使用猪肝细胞型EBLSS治疗的患者进行的回顾性检测亦未有PERV感染的确切证据。 由此得出以下结论:(1)初步建立了PERV的检测方法,使用该方法可对猪源性组织或细胞进行可靠、有效的监测。(2)在生物反应器培养细胞的早期,细胞能够维持较好的生物学功能,其长期活性尚需进一步研究;(3)在模拟生物人工肝进行治疗时,可检测到病毒的释放,而通常所使用的生物反应器半透膜并不能阻止病毒的透过。(4)培养猪肝细胞所释放的PERV未见能感染胎肝细胞,对已行生物人工肝治疗的患者亦未发现PERV感染的确切证据,故提示使用猪肝细胞进行生物人工肝治疗可能是安全的。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R575

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【参考文献】
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