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《第三军医大学》 2003年
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邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯降解菌的分离及其降解功能研究

陈济安  
【摘要】: 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP]是一种典型的邻苯二甲酸酯类物质,用途非常广泛,用于农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去污剂的生产原料,特别是作为塑料添加剂,在重量上可达20%~50%。由于在塑料及其它制品中,DEHP呈游离状态,随着时间的推移,极易转移进入环境,从而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。目前,DEHP已成为全球最普遍的污染物之一,并被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物。由于DEHP的水解、光解和挥发速率非常缓慢,生物降解是DEHP在环境中分解的重要途径。尽管土壤中存在许多能降解DEHP的菌种,但由于其自然降解能力极弱,远远不能满足DEHP环境污染治理的需要。因此,对DEHP的处理有待于寻求高效降解菌。DEHP的生物降解研究现已成为国内外研究热点之一。本实验采用梯度式压力驯化法从污染环境中分离到两株高效DEHP降解菌,并对其相关性状进行了研究。 (1)降解菌的驯化分离及鉴定:采用梯度式压力驯化法,从污水处理厂的活性污泥和塑胶厂排污出口泥土中分离到两株DEHP降解菌CQ0110Y和CQ0110G。两菌株均能以DEHP为唯一碳源和能源生长。通过菌株的培养特性、革兰氏染色及显微镜下观察、触酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、氧化发酵试验、动力试验、尿素酶试验、各种碳源利用试验以及药敏试验研究,根据伯杰氏细菌分类手册第八版和第九版中描述的模式菌株对照,采用Vitek全自动微生物鉴定仪进行鉴定,确定两菌株均为革兰氏阳性菌,归属于乳杆菌属,其中,CQ0110Y为棒状乳杆菌(L.coryniformis),CQ0110G为绿色乳杆菌(L.viridescens)。 (2)最佳降解条件研究:通过测定不同pH、温度、菌种量以及振荡培养速度下两菌株对DEHP的降解效率,确定最佳降解条件。结果表明, CQ0110Y的最佳pH为6.0~8.0;最佳温度为20~35℃;最佳接种量为0.4%~2%;最佳振荡速度为50r/min~150r/min。CQ0110G的最佳pH 6.0~7.5;最佳温度为25~35 ℃;最佳接种量为0.4%~2%;最佳振荡速度为50r/min~150r/min。 (3)降解动力学研究:通过测定两菌株对不同初始浓度DEHP在不同时间的降解情况,采用SPSS10.0统计软件进行反应动力学模型的选择,确定两菌株对DEHP生物降解反应动力学模型均符合指数模型。经对不同初始浓度下降解动力学方程进行 WP=7 曲线拟合后,发现当DEHP初始浓度低于1350 mg/L时,两菌株对不同初始浓度DEHP降解反应分别符合同一指数动力学模型。动力学方程为:CQ0110Y,㏑C=-0.4087t+A;CQ0110G,㏑C=-0.2706t+A。半减期t1/2为:CQ0110Y, t1/2= 1.59d;CQ0110G,t1/2= 2.00d。 (4)降解性能比较:通过两菌株对PAEs家族中几种主要物质(DMP、DEP、DBP、DOP、DEHP)的降解性比较,发现两菌株对DEHP的降解性优于其它几种PAEs,而对其它PAEs的降解性随其碳链的增加而降解能力下降。 (5)降解酶研究:通过胞外酶(透析液)、胞内酶(细胞碎片和无细胞提取液)对DEHP的降解活性比较,发现透析液及细胞碎片均没有DEHP降解活性,而无细胞提取液有较高的降解活性,从而确定两菌株降解酶都属于胞内酶,而且主要集中在溶液部分(粗酶液)。研究表明,CQ0110Y粗酶液在pH6.0~8.0之间较为稳定,CQ0110G粗酶液在pH6.0~7.5之间较为稳定;两菌株的粗酶液在10℃较为稳定,25℃时稳定性稍差,50℃时活性几乎无法维持稳定。提示粗酶液需在低温下储藏,一般置4℃冰箱保存。 (6)酶促降解途径研究:通过测定不同时相点粗酶液对DEHP的降解产物,推测DEHP的酶促降解途径可能为:DEHP在酯酶作用水解成MEHP,继续水解成邻苯二甲酸,进一步降解成苯甲酸,苯甲酸在加氧酶作用下形成对羟基苯甲酸,对羟基苯甲酸脱羧基生成苯酚,经还原反应生成环己醇,进而转化成丙酮酸、琥珀酸、延胡索酸等进入三羧酸循环,最终转化为二氧化碳和水。 (7)降解质粒研究:采用常规的碱裂解法对DEHP降解菌进行质粒提取,电泳结果表明菌株CQ0110G无质粒存在;而菌株CQ0110Y包含一大小约19kb的质粒。质粒消除实验表明消除质粒后的菌株丧失了对DEHP的降解活性;质粒转化实验表明该质粒可对DH5α大肠菌转化,但在现有条件下转化子没有表现出DEHP的降解活性。提示菌株CQ0110Y对DEHP降解可能与其中的质粒有关。转化子没有表达DEHP降解活性的原因有待进一步研究。 总之,我们从环境样品中分离到了两株DEHP降解菌并进行了菌株鉴定;摸索出了最佳的降解条件以及对其降解动力学规律有了较为清楚的认识;实验发现两菌株降解酶均属于胞内酶,对这些降解酶的pH稳定性及温度稳定性进行了研究;测定了两菌株粗酶液对DEHP的降解产物,推测DEHP可能的酶促降解途径;对两菌株的降解质粒进行了初步研究。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:X703

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【引证文献】
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