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《第三军医大学》 2004年
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外加电场干预对体外培养大鼠血管平滑肌细胞部分生物学行为的影响

唐波  
【摘要】:背景和目的:血管损伤后新生内膜形成是血管再狭窄(restenosis,RS)等病变的病理基础,严重影响了经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)的远期疗效,因而对RS的防治成为心血管病领域研究的重要课题。RS发生是一个复杂的过程,球囊损伤,局部血管内膜撕裂,加之继发的炎症刺激,使局部血管组织细胞的生物学特性发生改变,损伤的内膜创面不能及时修复,中膜层血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)通过损伤的内弹力层向内膜下迁移,并发生增殖,最后导致增生的新生内膜形成。有效干预损伤局部血管组织细胞的生物学行为,促进内皮细胞修复,抑制VSMCs向内膜下的迁移,是RS防治研究的重要内容之一。 对胚胎发育中组织形成、炎症反应及损伤修复的细胞生物学研究结果发现,局部组织或细胞存在着内生性电场(electirc fields, EFs),这一EFs正常时处于一种动态平衡状态。在一定因素作用下,如处于组织的胚胎发育期、损伤及炎症因子作用等,可改变局部的电场平衡,形成电位差,使细胞定向、有序生长,是最终形成组织或修复组织的一个重要条件。关于EFs对细胞生物学行为影响的进一步研究表明,在EFs作用下,细胞顺EFs方向进行恰当的趋化运动,在胚胎期主要是形成组织和器官,而在成年动物则主要参与组织的损伤修复。 血管RS的发生中,VSMCs通过损伤的弹力纤维层向内膜下迁移并发生增殖是其关键因素之一,因此,对RS发生中有关细胞生物学行为的干预和调节就是其防治的最关键环节。局部EFs对细胞的生物学行为有着明显影响,使细胞定向迁移,那么,可不可以通过外加局部EFs的方式,在血管RS的防治中应用EFs的这一作用呢? 本课题拟设计制作体外干预EFs发生装置,利用该装置作用于培养的大鼠VSMCs,研究EFs对VSMCs迁移、增殖行为的影响,以及EFs影响细胞运动的发生和调控机制。为调控VSMCs迁移行为寻找新的方法和技术。 方法:(1)参考国外文献报道,改进外加EFs干预装置,包括电源、电极系统、细胞培养室,可以模拟生理EFs,作用于培养的VSMCs,并能在显微镜下动态观察细胞行为的改变。(2)采用胶元酶消化法培养大鼠主动脉VSMCs,较早期传代细胞用于实验。(3)采用EFs干预培养的VSMCs,细胞置于显微镜培养条件或细胞培养箱中。 WP=11 CCD间断显微细胞图象记录和分析,研究不同强度EFs、不同作用时间对VSMCs迁移和细胞形态的影响。采用免疫细胞化学染色方法观察EFs作用后VSMCs PCNA表达情况,研究细胞增殖改变。(4)CCD间断显微细胞图象记录和分析,研究不同细胞生长因子、不同浓度AngⅡ参与情况下,EFs对VSMCs迁移行为的影响。(5)采用免疫细胞化学或免疫荧光染色方法检测EFs干预后,与VSMCs迁移密切相关的PDGFR、AT1R和AT2R等受体的表达情况,研究EFs影响VSMCs发生的机制。(6)采用激光共聚焦技术检测EFs干预后,与细胞运动行为有关的肌动蛋白细胞骨架F-actin的表达,研究EFs作用的可能机制。 结果:(1)改进并制作EFs干预装置,使电源可以输出微安级强度的直流EFs,精确可调,模拟生理EFs;电极系统具有良好的导电性,可避免电极电解产物进入培养基,保持培养基的稳定性;细胞培养室明显提高局部电阻,最大限度保证局部环境稳定,减少生理EFs的电流和欧姆热,可以保证细胞在培养条件下长期存活,并能在显微镜下观察细胞行为。以上条件保证EFs干预条件稳定可靠,可用于EFs影响VSMCs行为的研究。(2)采用胶元酶消化法进行大鼠主动脉VSMCs的原代培养,所得细胞形态和生长稳定,经形态学和α-SM-actin免疫细胞化学染色鉴定证实为VSMCs,采用较早期传代细胞进行研究。(3)在含有10%FBS的培养基中,细胞在EFs作用下显示明显的趋化反应。在100~250mV/mm EFs中,细胞向阴极迁移。对单个细胞和细胞团,在150mV/mm,细胞定向迁移的速度没有明显提高。150mV/mm EFs长时间作用于培养的VSMCs,细胞向阴极迁移的距离明显高于无EFs作用对照组,细胞向阳极迁移受到抑制。EFs作用下,部分细胞的片状伪足向阴极面伸展。细胞向阴极迁移,需要培养基中血清存在。在无血清的培养基中,细胞在250mV/mm EFs中没有定向迁移。(4)150mV/mm EFs长时间作用于培养的VSMCs,在24、48、72小时,细胞PCNA表达与对照培养细胞未见明显差异。(5)在无血清培养基中补充PDGF-BB、bFGF、TGF-β1时,部分恢复细胞向阴极迁移。其中PDGF-BB的作用较强,与DMEM培养VSMCs相比,DMEM + PDGF-BB培养VSMCs向阴极迁移明显增强,但仍然低于DMEM +10%FBS培养VSMCs。bFGF和TGF-β1作用类似。(5)在150mV/mmEFs中,DMEM +10%FBS +10-6、10-7 mol/L AngⅡ培养VSMCs明显向阴极迁移,与DMEM +10%FBS培养VSMCs相差显著。DMEM +10-6、10-7 mol/L AngⅡ培养VSMCs在EFs中迁移速度增加,没有定向改变。(6)EFs 150mV/mm,干预DMEM +10%FBS培养VSMCs ,细胞内PDGFR表达增加,部分细胞内PDGFR表现为不对称分布,集中在细胞朝向EFs阴极面的胞浆中。PDGFR上调在EFs作用5分钟即出现,可持续6小 WP=12 时。(7)EFs 150mV/mm,干预DMEM +10%FBS培养VSMCs ,细胞内AT1R表达增加,可持续6小时以上,没有发生细胞不对称分布。AT2R表达没有改变。(8)EFs150mV/mm,干预DMEM +10%FBS培养VSMCs,激光共聚焦显微镜显示EFs作用5分钟,胞浆内F-actin分布即开始
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

【引证文献】
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【参考文献】
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5 方正旭;pp60~(c-src)及Jak2在凝血酶诱血管平滑肌细胞增生中的作用[D];江西医学院;2003年
6 王麟;血管紧张素Ⅱ对高糖培养大鼠血管平滑肌细胞核转录因子κB活化的影响[D];中国医科大学;2004年
7 李林峪;Geminin基因过表达对VSMCs表型转化的影响及其分子机制探讨[D];第三军医大学;2012年
8 孙文杰;急性冠脉综合征CD4~+CD28~-T细胞诱导VSMCs凋亡的机制[D];哈尔滨医科大学;2011年
9 王子东;脱氢表雄酮对雄鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制的初步研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
10 郭晓纲;H_2O_2对血管平滑肌细胞增殖和对MMP-2、TIMP-2基因转录的作用研究[D];浙江大学;2001年
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