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《第三军医大学》 2004年
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CD147分子在胆管癌浸润及转移中作用及机制的研究

贺伟旗  
【摘要】:胆管癌是常见的胆道恶性肿瘤之一,其发病数呈逐年增加趋势。胆管癌的局部浸润和转移一直都是困扰治疗的难题。由于肿瘤所在的特殊位置及其向邻近组织、血管、神经浸润和向肝内胆管扩展的特点,传统的治疗方法难以取得满意的疗效,这促使我们更深入的探讨胆管癌浸润和转移的特点及机制。 CD147是一类属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,曾有多种不同的命名,包括人体内的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Extracellular metallopoteinase inducer, EMMPRIN)、M6、基础免疫球蛋白(Basic immunoglobulin,Basigin)、Neurothelin等,第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将来自各实验室的不同命名统一为新的CD编号CD147。CD147在机体内的分布很广,参与机体生殖、免疫和神经活性等重要生理过程,并与肿瘤的增殖、扩散密切相关。 在多种肿瘤均发现有CD147表达的增高,在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高,CD147的表达也增高,并与肿瘤的浸润和转移相关。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是肿瘤降解细胞外基质的主要酶类,CD14不仅能刺激纤维母细胞产生MMP-1、MMP-2、MMP-3等MMPs,还能与MMP-1在肿瘤细胞表面结合形成复合物,从而促进肿瘤的浸润。虽然CD147能刺激肿瘤组织或瘤周的成纤维细胞产生MMPs,但在成纤维细胞和结缔组织中没有发现CD147分子受体的表达,因此,推测CD147可能是通过目前尚没有发现的细胞表面分子受体来发挥作用。 作为MMPs上游分子的CD147,相信阻断其表达或抑制其功能将会有效地抑制肿瘤的发展。为此,本实验首先证实了CD147分子在胆管癌细胞株QBC939中的表达,通过DNA技术构建了携带反义CD147分子基因片断的重组腺病毒,从分子水平抑制胆管癌细胞株CD147分子的表达,以分析CD147分子与胆管癌浸润和转移的关系,探讨其对胆管癌浸润及转移过程的影响及可能机制,希望找出抑制胆管癌浸润和转移新的生物学治疗措施。 主要的结果及结论如下: WP=13 1.本课题首先采用RT-PCR和免疫荧光法,观察人胆管癌细胞株QBC939中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA水平及蛋白表达。结果表明,在人的胆管癌细胞株QBC939中有丰富的CD147、MMP-2及MMP-9 表达。因此,以CD147分子为靶点,阻断其信号传导途径来治疗胆管癌的理论上是成立的,为下一步的研究打下了基础。 2.运用DNA重组技术,成功地构建了携带反义CD147分子片段的pshuttle-cmv重组质粒,经酶切鉴定腺病毒的重组质粒构建成功。 3.将重组质粒pshuttle-cmv-asCD147酶切后所获得的反向CD147分子片段与Adeasy-1在BJ5183工程菌中同源重组,成功获得重组的23Kb片段,将其通过脂质体包裹方法转入293细胞,获得了重组携带反义CD147分子片段的重组腺病毒,经氯化铯超速离心获得了高滴度的反义CD147重组腺病毒,经PCR鉴定,构建的腺病毒有目的基因的表达,是具有完整功能和感染能力的腺病毒。 4.重组腺病毒转染体外培养的QBC939细胞,MTT和FCM方法检测了重组腺病毒转染对细胞生长的影响,结果表明,重组腺病毒并不影响QBC939体外的生长速度及细胞周期。在mRNA和蛋白水平,通过RT-PCR和Westernblot检测证实了反义CD147转染后对体外培养的QBC939细胞表达内源性的CD147及MMP-2有明显的下调作用,对MMP-9的表达无明显影响。 5.通过浸润实验证实体外转染反义CD147的QBC939细胞与成纤维细胞共培养后,QBC939细胞体外的浸润能力明显下降;凝胶酶谱分析表明共培养后培养上清中MMP-2及MMP-9活性及含量明显下调;粘附实验也证实转染反义CD147可使胆管癌细胞与成纤维细胞及细胞外基质的粘附能力明显下降。 6.建立了稳定的人胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型,运用免疫组织化学、RT-PCR及Westernblot等方法,研究了反义CD147基因转染对肿瘤生长影响及可能机制。结果表明反义CD147通过抑制肿瘤细胞的CD147分子的表达,减少了肿瘤组织中MMP-2及MMP-9的表达,从而导致肿瘤的生长抑制。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R735.8

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