1，3-丁二烯职业暴露人群HPRT基因分子突变机理的初步研究

【摘要】：人类的生存空间中存在着大量的有害外来化合物(包括物理的、化学的与生物的),可能损害人类的遗传物质(染色体、基因与DNA等),诱发高频率的突变,进而对人类健康和物种品质构成危害。HPRT基因正向突变试验是国内外广泛采用的突变检测方法。以往进行HPRT基因的致突变检测主要有两种方法,即放射自显影法与多核细胞检测法,虽然这两种方法简单、快速,但主要的缺陷是不能进一步确定突变细胞的来源(基因突变的定位与定性),这一直是制约HPRT基因突变研究深入发展的重要因素。突变克隆检测法由于克服了前两种方法的主要缺陷而得到日益广泛的应用,已成为人类HPRT位点研究的最有价值的方法。因此选择合适的方法“证实人类HPRT基因突变资料和获取其分子突变谱”已成为今后致突变研究的“最紧迫的任务之一”。通过运用上述各种基因突变检测技术,国际上已积累了大量的有关HPRT基因位点突变的资料,并构建了初步的HPRT位点突变图谱数据库,国际组织多次倡导进行各种可疑诱变物对不同细胞系在体内或体外的致突变检测,收集尽可能多的HPRT突变图谱资料,汇集成数据库,为进一步研究突变机理、突变热点以及体内外突变图谱的比较打下基础。 另一方面,1,3-丁二烯(BD)是一种重要的工业原料,广泛用于合成橡胶、塑料等石油化工与制造行业中。由于发现BD在汽车尾气、香烟烟雾以及食用油油烟中普遍存在,因此BD污染危害可能已超出了职业性范围。考虑到在很低的暴露水平下(13.75mg/m3)就能引起实验动物发生肿瘤,美国最近再次把BD的职业暴露阈值从22mg/m3降至2.2mg/m3,而我国卫生标准定为100mg/m3(1979年),提示现行的卫生标准已不足以保护工人及其后代的健康。目前认为BD对动物体细胞和生殖细胞均有致突变作用,并且是肯定的动物致癌物,但迄今为止,有关BD对人的致突变研究报告很少,且存在争议。因此,本课题首先以几种理化因素为模型在实验室建立起HPRT基因突变分析方法,然后利用现场流行病学调查和实验室分子生物学研究相结合,以74例BD暴露组工人与157例对照组人群为对象,测定了工作场所空气中BD含量,调查受试者一般健康和生活习惯背景,并进行了职业健康检查;通过对其外周血淋巴 WP=13 细胞克隆培养,测定了231例受试者细胞克隆效率与HPRT基因突变频率;利用多重PCR技术对783个HPRT基因突变体9个外显子的缺失情况进行了分析,并进一步采用RT-PCR与cDNA测序研究了146个点突变体,初步探讨了BD暴露组工人与对照组人群HPRT基因的分子突变谱及其相关机理。研究内容包括三部分:(1)以几种理化因素为模型在实验室建立HPRT基因突变分析方法;(2)BD生产车间作业工人职业暴露监测及相关健康检查;(3)BD作业工人淋巴细胞HPRT基因突变频率及分子突变谱的实验研究,主要结果如下: 1.根据我们的现场调查,并参考国内外相关研究资料,总结出选择BD职业暴露现场的4条标准与2个参考因素,应用于本次研究中,选定符合试验要求、具有代表性的BD生产现场:南京扬子石化公司烯烃厂BD车间;现场调查BD车间生产工艺与作业工人工作流程,结合受试对象一般健康与生活习惯背景资料,选择BD暴露组与对照组,确定空气监测采样点,测定BD含量,暴露组工作地点BD含量为20.79±34.95mg/m3,而对照组工作地点均低于检测下限。本研究方法也可供其它职业接触化合物现场调查时借鉴。 2.受试对象职业健康检查发现,在涉及神经系统、呼吸系统以及生殖系统的主诉症状方面,BD暴露组明显高于对照组(P0.05);血液学检查方面,BD暴露组血红蛋白明显低于对照组(P0.05),并且红细胞计数也下降;特殊检查方面,BD暴露组的心电图异常比例明显高于对照组(P0.05),主要表现为“T波低平”。结果提示,BD对职业暴露人群具有一定的毒性作用,其临床表现是多方面的,可能在人体内存在多种靶器官和组织。 3.测定了74例BD作业工人与157例对照人群的外周血淋巴细胞克隆效率与突变频率,BD暴露组的细胞克隆效率没有变化,但突变频率(18.24±9.35×10-6)比对照组(12.74±7.33×10-6)升高。尽管本次实验对照组与其它同类研究对照组相比,突变频率较高,造成本实验两组之间统计学差异不显著,但仍具有实际意义,提示BD对人具有潜在的致突变作用。可以推测国际上对此问题的争论可能主要来自对照组选择的不同。 4.本试验测定了415个对照组突变体与368个BD暴露组突变体,对照组突变体中大多数是点突变(87.5%),其比例高于BD暴露组(72.6%);但BD暴露组工人外显子缺失发生频率(27.4%)明显高于对照人群(12.5%)(P0.05),其中主要是多外显子连锁缺失比例升高(P0.05)。结果表明在外显子水平BD接触对职业人群具有明确的致突变作用。 WP=14 5.本试验对71个来自对照组的突变体与75个来自BD暴露组的突变体进行了序列分析,BD暴露组单碱基置换发生率(61.3%)明显低于对照组(80.3%),但其中A:T→T:A 颠换发生率反而明显高于对照组(P0.05)。BD暴露组±1移码突变发生率(22.7%)也明显高于对照组(7.0%)。结果显示BD暴露组与对照组在碱基突变谱总体上也存在明显差别。 6.测序中发现1个新的HPRT基因突变位点:73位点,并在3个已知突变位点上观察到新的突变类型:149(C→T)、395(T→A)与430(C→T)位点,但这些突变可能是自发突变事件,而与BD暴露无关。这些