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《第三军医大学》 2004年
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CT-1基因及其修饰的神经干细胞移植对创伤性脑损伤的修复作用

杨云华  
【摘要】:创伤性脑损伤(TBI)诱发神经元病理性坏死和凋亡是脑功能障碍的重要原因。脑创伤后机械性损伤导致神经元直接损伤死亡,伴随脑水肿、缺血及再灌注等继发性损伤引起离子失衡、兴奋氨基酸增加及其受体激活、氧自由基、NO释放增加等改变和细胞内环境紊乱,可造成继发性神经元损伤和凋亡。 TBI后的治疗措施有:挽救受损神经元的迟发性死亡;促进神经元轴突的再生;组织移植替代神经元缺损。目前的研究,主要运用神经营养因子 (NTs)、促神经生长因子(neuropoietic cytokines)、细胞保护因子(bFGF等)、再生相关因子(RAGs)等促进神经元生长存活以及轴突再生,以组织细胞移植替代缺损的神经组织,其目的是减少受损神经元迟发性死亡,提供一个有利于神经轴突再生的微环境,使移植细胞组织在宿主实现解剖重建,促进神经功能恢复。 成年哺乳动物的中枢神经系统(CNS)损伤后不能再生,神经联接和功能重建能力差,是脑创伤后神经功能恢复困难的主要原因。但近年实验发现成年CNS中仍然存在少量具有分裂增殖和多分化潜能的神经干细胞(NSCs),可分化为CNS中的神经元和神经胶质细胞,对CNS损伤的修复有潜在意义,但对创伤性脑损伤,内源性NSCs远远不够修复脑组织创伤后的神经缺损。NSCs的发现给CNS疾患和损伤的治疗修复带来了希望。NSCs具有自我更新和多向分化潜能,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。从再生方面人们把NSCs视为CNS移植和替代治疗的理想材料,国内外学者在CNS损伤后应用NSCs移植治疗神经功能障碍的实验研究和临床应用中获得了一定结果,但NSCs移植后在宿主中的生长分化和轴突重建仍是目前的难点。 心肌营养素-1(CT-1)是近年发现并被逐渐深入研究的一种细胞因子,与节状神经营养因子(CNTF)同属于促神经元生长细胞因子家族(neuropoietic cytokines family),能够刺激体外新生大鼠心肌的生长,故命名为CT-1。近来人们注意到CT-1在CNS中也有重要作用,能支持运动神经元、多巴胺神经元、交感神经元和脊髓运动神经元存活,诱导交感神经元的表型连接。目前认为,CT-1可能是靶源性和/或自分泌/旁分泌的运动、感觉神经元的营养因子,有比CNTF更强的对神经元存活的调节作用。实验证明,脊髓损伤(SCI)后CT-1的基因治疗可明显增加神经元的存活数量和损伤神经功能的恢复, WP=13 CT-1联合胶质源性神经营养因子(GDNF )治疗可促进周围神经再生,CT-1基因治疗大鼠进行性运动神经元病也可明显改善动物的神经功能障碍。 应用细胞因子治疗脑损伤时,因为直接使用细胞因子作用存在血脑屏障、体内半衰期较短等问题,因而限制了其应用。腺病毒对神经细胞有着特异性亲和性,重组腺病毒(Adv)可作为良好的基因载体将目的基因导入NSCs或神经元,使外源性基因在细胞中转录、复制,从而在宿主特定部位的细胞中较长时间持续表达。有实验证明,以GDNF和CT-1基因的腺病毒转染对PC12细胞的保护作用可明显大于直接使用细胞因子。对NSCs在移植前进行特定的基因修饰,使NSCs成为良好的基因载体,为NSCs以及特定基因的移植治疗神经缺损提供了新的方法。NSCs移植后在大脑局部增殖分化可替代损伤缺失的脑组织,修饰的外源性神经保护因子则可促进损伤细胞和移植细胞的存活,有利于神经功能恢复。 CT-1能否挽救损伤大脑神经元的迟发性死亡,是否对NSCs的生长存活有保护作用,能否促进移植到损伤大脑内的NSCs在宿主内的存活与分化,这些问题目前尚未见有关文献报道。本实验拟通过体外实验研究CT-1对NSCs和神经元的作用,于在体实验进一步研究CT-1对脑创伤的治疗效应以及对NSCs在体内生长分化的作用,了解CT-1对CNS的作用和机理,为脑创伤提供新的治疗策略。 本实验目的主要在体外培养的NSCs和神经元模型上观察重组腺病毒-CT1(Adv-CT1)的作用;制备脑创伤模型基础上,观察Adv-CT1对损伤神经元存活的保护作用,Adv-CT1及其修饰的NSC(NSC-CT1)脑内移植治疗TBI后的脑功能障碍的作用,探索CT-1和NSCs对TBI治疗的作用和机制。 主要技术路线和方法: 1.分离、培养和鉴定大鼠NSCs,以Adv-CT1转染NSCs,应用流式细胞仪凋亡检测、细胞突起计数等技术,观察CT-1对NSCs存活和分化的作用。 2.建立H2O2氧化应激诱导神经元凋亡损伤模型,以Adv-CT1转染损伤神经元,应用流式细胞仪凋亡检测、免疫组化等技术,观察CT-1对神经元生长存活的作用。 3.建立大鼠TBI模型,以Adv-CT1转染治疗后应用电镜、原位凋亡检测、流式细胞仪凋亡检测、免疫组化、水迷宫试验和穿梭箱试验等检测技术,观察CT-1对TBI后神经功能障碍的修复作用。 4.在大鼠TBI模型上,以CT-1基因修饰的NSCs移植治疗,应用移植细胞示踪、免疫荧光、水迷宫试验和穿梭箱试验等检测技术,观察CT-1基因修饰的NSCs移植后在宿主损伤脑区中的存活分化及其对TBI后神经功能障碍的影响。 WP=14 主要结果和结论: 1.从胚胎大鼠大脑分离出NSCs,采用条件培养基成功培养NSCs,经Brdu掺入实验证明NSCs具有分裂增殖能力;以免疫组化检测NSCs标志物nestin、神经元标志物NF-200和胶质细胞标志物GFAP,证实经诱导NSCs可分化为神经元和胶质细胞,具有多向性分化潜能。以Adv-CT1转染NSCs后应用免疫组化技术,检测到NSCs中CT-1表达明显增强,并可持续表达;荧光显微镜下观察到
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R651.15

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【参考文献】
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