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《第三军医大学》 2004年
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Calpain inhibitor I对创伤应激相关功能调控的实验研究

程晓刚  
【摘要】:糖皮质激素(Glucocorticoids, GC)是机体重要的应激激素和临床常用抗炎、抗免疫反应药物,其受体(Glucocorticoid receptor, GR)对其效应发挥起关键作用。急性应激状态下,机体分泌大量糖皮质激素,作用于其受体,能够抑制炎性介质和细胞因子的生成与释放,对于调控应激反应早期肝脏急性期反应和炎症反应起重要作用。我们以往的研究表明,在严重创伤等急性应激状态,HPA轴反应亢进,GC分泌显著增加,但组织细胞糖皮质激素受体(GR)表达却下调与功能抑制,而且伤情越重,GR功能降低越明显。GR、功能抑制必然会使其抗炎调控作用减弱,当炎症反应失控后,就会导致继发性全身损害的发生,最终会导致多器官功能障碍(MODS)和多器官功能衰竭(MOF)。因此在严重创伤后存在高炎性介质分泌、高GC分泌和组织GR表达与功能降低的矛盾,提高应激时机体GR水平是改善应激紊乱、减轻继发损害的突破口。 近来国外研究表明大量应用糖皮质激素可以引起配基诱导GR下调,该作用是通过泛素-蛋白酶体降解系统所介导的。机体在严重创伤情况下存在GC过度分泌,另外临床创伤救治过程中有可能应用大剂量GC,说明严重创伤时存在激素诱导受体下调的诱因。而Calpain inhibitor I属一种可逆性蛋白酶体抑制剂,研究证实Calpain inhibitor I可缓解酵母多糖诱发大鼠多器官功能衰竭,并改善缺血再灌注引起的细胞损伤,减少产生过多的氧自由基和硝基化合物。但应用Calpain inhibitor I能否抑制泛素-蛋白酶体降解系统,改善急性应激状态GR下调,国内外尚无相应文献报道。本课题旨在研究Calpain inhibitor I对GR表达与转录激活功能的影响,探讨应用蛋白酶体抑制剂是否可抑制糖皮质激素介导的受体下调及促进其功能发挥。为此我们先研究了Calpain inhibitor I对RAW264.7细胞GR表达与转录激活功能的影响,在体外探讨Calpain inhibitor I是否对GR表达与转录激活有促进作用。国外实验发现Calpain inhibitor I可抑制iκB降解,因此我们也观察了Calpain inhibitor I对LPS攻击RAW264.7细胞iκBα降解与细胞因子分泌的影响,以探讨Calpain inhibitor I是否可以有效抑制NF-κB活化与炎性细胞因子的分泌。并以小鼠15-20% TBSA III℃烧伤为实验模型,探讨早期创伤Calpain inhibitor I是否可以抑制GR表达下调与NF-κB活化、降低炎性细胞因子分泌。并将其地塞米松(DEX)联合使用,观察两者合用是否对抑制NF-κB活化、降低细胞因子分泌与改善组织损伤更为有效。从而为临床治疗严重创伤急性应激不良 WP=14 提供新的思路,为有目的地提出和设计抑制严重创伤引起的全身炎症反应综合症(SIRS)和多脏器功能障碍综合症(MODS)等继发性全身性损害提出新的治疗措施和手段。 c-Jun蛋白是参与急性应激反应的重要蛋白,在诱导炎性介质的分泌中起重要作用,在以往实验中我们观察到烧伤小鼠肝脏JNK磷酸化水平增加,本实验我们观察了小鼠15-20%TBSAIII度烧伤后肝脏c-Jun蛋白表达水平的变化,并在体外分别采用基因转染和RNA干涉技术提高或降低细胞c-Jun水平来检测GR蛋白表达和转录激活活性的变化,以弄清c-Jun对GR蛋白表达与功能的影响,为纠正急性应激失控性GR下调与功能抑制提供新的思路。 主要的研究结果及结论如下: RAW-264.7细胞经地塞米松处理12h后, 糖皮质激素受体表达下调,Calpain inhibitor I可抑制此作用。COS-7细胞转染hGRα基因及其报告质粒pMAMneo–CAT,检测CAT活性,表明Calpain inhibitor I可增强GR转录激活作用。 LPS攻击RAW-264.7细胞,胞浆内游离Ca2+水平迅速增加,随之iκbα蛋白表达下调, Calpain inhibitor I可抑制LPS诱导iκbα降解, Calpain inhibitor I与地塞米松联合使用对抑制iκbα降解有协同作用。LPS攻击RAW-264.7细胞4h与8h后培养上清TNF-α、IL-6分泌增加,Calpain inhibitor I和地塞米松均抑制LPS处理后TNF-α、IL-6的分泌,并与地塞米松有协同抑制作用。 小鼠15-20% TBSA III度烧伤12h血清IL-1β、TNF-α、IL-6分泌显著增加, Calpain inhibitor I不抑制烧伤后TNF-α的分泌,可抑制IL-1β、 IL-6分泌;Calpain inhibitor I协同地塞米松抑制炎性细胞因子分泌。烧伤后12h小鼠血清尿素氮、肌酐、AST、ALT含量升高,地塞米松和 Calpain inhibitor I均抑制其增加,除AST外,两者无明显协同抑制作用。EMSA实验表明Calpain inhibitor I和地塞米松抑制NF-κB转录活性,两者有协同抑制作用。小鼠烧伤12h后肝、肾iNOS、COX2表达增加,Calpain inhibitor I与地塞米松可抑制烧伤后iNOS、COX2表达,但与地塞米松无协同抑制作用。Western-blot表明Calpain inhibitor I可抑制烧伤后12h、24h小鼠肝脏GR 表达下调,且抑制小鼠烧伤后地塞米松处理12h肝脏GR下调。 小鼠15-20%TBSAIII度烧伤后肝脏c-Jun蛋白表达增强,应用RNAi技术构建人PAVU6-cJun siRNA干涉质粒,将其与含人c-Jun蛋白全长cDNA质粒pCMV-cJun及缺失c-Jun转录激活区质粒pCMV-TAM67分别电转染U937细胞。PAVU6-cJun siRNA转染后c-Jun表达减少,GR 表达升高;pCMV-cJun和 pCMV-TAM67转染后c-Jun表达增加,GR 表达降低。c-Jun和TAM67均抑制GR表达,提示转录激活区对c-Jun抑制GR表达不起主要作用。 WP=15 将pCMV-cJun、pCMV-TAM67、PAVU6-cJun siRNA质粒和
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R641

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【参考文献】
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