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《第三军医大学》 2004年
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PPARγ对骨髓MSC向心肌样细胞分化的影响及调控作用的研究

林先和  
【摘要】:研究背景: 心肌细胞在出生后就不能再生,对有丝分裂信号的反应是细胞肥大而不是增生。心肌细胞的丧失会导致所在区域心肌收缩功能减退,以致心力衰竭,坏死心肌终而被成纤维细胞形成的疤痕组织所取代。近年来,采用自体细胞和生长因子修复组织的再生医学迅猛发展。有人将培养的心肌细胞移植到损伤区心肌内能够明显改善心功能,并称之为“细胞心肌成形术”(cellular cardiomyoplasty),有可能成为治疗心力衰竭的有效手段。许多作者对胚胎干细胞诱导成心肌细胞进行了大量研究,并取得了显著进展。但是,胚胎干细胞移植仍然存在许多问题,诸如免疫排斥,伦理道德问题等。继胚胎干细胞后,骨髓间充质干细胞(MSC)受到了高度重视。来源于中胚层的MSC,是多能干细胞,在诱导后可以定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞以及肌腱细胞等多种细胞。MSC与心肌细胞同属于中胚层。近期已经有人应用5-氮杂胞苷(5-Aza)成功地将体外培养的MSC诱导成为心肌样细胞。Tomita等将人骨髓MSC植入免疫缺陷鼠心肌后,发现这些细胞可分化成为心肌细胞,且表达心肌细胞特有的desmin,α-actin,β-MHC2。有作者将骨髓MSC注射入心梗边缘部位心肌内,这些移植的MSC分化成为心肌细胞,且受损的心功能得到明显改善。进一步研究表明,MSC经5-Aza诱导后分化为心肌样细胞再行移植受损心肌部位,疗效明显优于未诱导组。目前对于骨髓MSC定向分化为心肌样细胞的研究处于起步阶段,心肌样细胞定向分化率仍然不高,对于心肌分化的调控机制研究甚少。因此,深入研究MSC分化过程中的调控机制对于寻求控制干细胞分化方向的手段,从而提高MSC向心肌样细胞定向分化率,促进细胞心肌成形术的应用有重要意义。 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)作为核激素受体超家簇中的成员,是细胞分化重要的调控因子。通过调节其他转录因子的表达,参与调节MSC分化,并在诱导MSC分化不同特异性表型之间起到开关作用。PPARγ在MSC向心肌样细胞分化过程中的作用如何,目前尚无相关报道。 资料显示,Nkx 2.5、GATA4、MEF-2C等基因是调控心肌细胞分化开始阶段的重 第三军医大学博士学位论文 要转录因子。本文应用培养小鼠MSC为研究材料,以5一Aza作为诱导剂,叫睬美辛 作为PPARY的配体,利用表达载体pEGFP一1一PPA助2转染MsC,检测PPA助对细 胞分化及其对转录因子MEF一ZC、Nkx2.5、GATA4 mRNA表达的影响,旨在探讨PPA助 对MSC分化为心肌样细胞的影响及其在分化过程中的调控作用。 方法与结果: 第一部分:探讨了小鼠MSC的体外分离、纯化、扩增、多向诱导和向心肌样细 胞定向分化的诱导条件。首先采用密度为1.082留ml的Percou细胞分离液分离小鼠骨 髓细胞中的单个核细胞,所获细胞应用DME树低糖培养基+l0%胎牛血清进行培养, 通过及时、反复传代对MSC进行纯化和扩增。平均5一6d在细胞达到80%左右融合时 进行传代。采用流式细胞仪检测细胞周期。应用不同的诱导方法对细胞进行多向诱导 分化,使细胞向成骨细胞、成心肌样细胞、成脂肪细胞三个不同的方向分化。诱导成 心肌样细胞分化时选取了5一Aza3林mol/L、5林mol/L、10林mol/L三种不同浓度。应用四 环素荧光标记检测钙结节,油红O染色检测脂滴,免疫组织化学检测ThT表达。 结果:MSC细胞形态保持均一的短梭形。12一14d细胞长成单层。细胞生长曲线: 第1、Zd细胞数量无明显增加,第3d开始细胞数量明显增加,MSC在第7d达到最 高峰。第8d开始进入平台期。细胞周期结果显示:MSC中GI期的细胞占91 .74%, S+GZ的细胞约占8.26%,表明只有少数细胞进入了活跃增殖期。成骨诱导后,细胞 出现钙结节。成脂诱导的细胞胞浆内出现大量脂滴。成心肌样细胞诱导中以5-Aza 3林mol几浓度为最佳,诱导后l月,部分细胞TnT表达阳性。5一Aza以5林mol/L及 10娜ol/L浓度诱导后虽有肌管样结构出现,但TnT表达始终呈阴性。 第二部分:应用叫噪美辛作为P队RY的配体作用于MSC以激活PPA助。将细胞 分为4组:A组用5一Aza3林mol/L诱导细胞分化;B组分别采用叼}噪美辛10一、10一,mol/L 两种不同浓度作用于MSC,观察细胞生长情况,形态变化;C组联用5一Aza鸿}噪美辛 作用于MsC;D组为对照组,不诱导。应用油红一O检测脂滴,免疫组织化学检测PPARY 表达情况。 结果:叫噪美辛在10一mol几浓度时对细胞有明显的毒性,而10一smol/L时细胞生 长良好。对照组及单用10一,mol几叫睬美辛作用Msc时,PPA助表达均呈阴性。单用 叫垛美辛并不能诱导MSC分化。单用5一Aza3卜mol几诱导后的第3d,部分细胞PPARY 表达阳性。联用6一Aza/叫噪美辛诱导时发现,诱导后第3d几乎所有细胞PPA助表达 阳性,继续培养后分化为脂肪细胞。 第三军医大学博士学位论文 第三部分:分题卜重组表达载体pCAG一PPARYZ及pEGFP一Nl。将前者中的 PPA助2目的片段构建入后者中。采用5’端一粘性末端一3’端平端构建策略对目的基因 进行亚克隆,构建成pEGFP一Nl一PPA助2表达载体。酶切鉴定与测序鉴定相结合。分 题2:经鉴定正确的重组质粒用脂质体转染法转染入MSC,应用吼;:并采用休克法进 行筛选
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

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【参考文献】
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