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《第三军医大学》 2004年
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大鼠嗅成鞘细胞和雪旺细胞基因表达差异的研究

袁碧波  
【摘要】:近年来对中枢神经系统再生能力的认识逐渐深入,发现移植外周神经雪旺细胞 (Schwann cells SCs)、嗅成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells OECs)均可以促进中枢轴 突再生,并且发现 OECs 脊髓移植促轴突再生效果优于 SCs,表现在再生轴突的延伸 距离、电生理及支持体重和运动功能的恢复等方面。OECs 抑制星形胶质细胞反应的 能力和较强的细胞迁移能力可能起了一定的作用,可能还有另外的一些未被发现的因 素在同时起作用。 嗅觉系统终生保持着神经再生的能力,嗅神经元存活周期为 4-8 周,衰老的神经 元由嗅上皮产生的新生神经元取代,重新发出轴突进入中枢的嗅球与靶细胞形成突触。 OECs 是伴随嗅神经形成髓鞘的神经胶质细胞,与嗅神经再生进入嗅球同靶细胞形成 突触密切相关,。OECs 在形态结构和功能上与 SCs 极为相似,体外培养两者均可呈梭 形,可以形成髓鞘,都可以分泌多种神经营养因子如神经生长因子(nerve growth factor NGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor BDNF)和睫状神经生长因 子(ciliary-derived nerve growth factor CNTF)。这两种细胞既相似又不同,为我们研究 神经再生提供了一个新的思路,两者进行比较可能发现有利于中枢神经再生的某些分 子。 本研究以 OECs 和 SCs 为实验对象,采用免疫溶解法获得两种细胞的纯培养,应 用免疫细胞化学(ICC)和电镜技术观察 OECs 的抗原表达以及形态特征。利用抑制消减 杂交技术(SSH)筛选两者的差异表达基因,从两者的差异表达基因中分析与中枢神经再 生相关的基因表达,为进一步阐述中枢神经再生机制创造条件。主要结果如下: 1.免疫溶解法获得 OECs 和 SCs 的纯培养 免疫溶解法纯化 2h 可见悬浮细胞增多,纯化后 24h 倒置显微镜下观察成纤维细 胞少见,P75NGFr 免疫组化显示 OECs 纯度可达 95%以上;继续培养 6d 后再次进行 纯化可去除大部分新增殖的成纤维细胞,保持 OECs 纯度在 95%以上。 2.ICC 技术研究 OECs 的抗原表达,电镜技术观察 OECs 的超微结构特征 OECs 免疫组化结果显示:P75LNGFr(+),GFAP(+),NCAM(+),CDK5(-)。 免疫 细胞化学特征为:P75LNGFr 染色均匀分布于整个细胞和突起,核区较为浅淡;GFAP 染色较深分布于整个胞浆和突起;NCAM 免疫阳性细胞表面均有分布。SEM 显示 OECs 4 WP=9 第三军医大学博士学位论文 核不规则,呈分叶状或齿状,核仁明显,染色质均匀分布于核中,异染色质可在核膜 下形成块状结构。 3.SSH 技术筛选 OECs 和 SCs 的差异表达基因 测序结果得到了 4 个不同的已知基因,分别编码:肝白血病因子(hepatic leukemia factor Hlf),糖基化磷脂酰肌醇磷脂酶 D1(Glycosylphosphatidylinositol phospholipase D1 GPLD1),Phr1(PAM)和缝隙连接蛋白亚单位 connexin43。在 4 个已知基因中,phr1 和 hlf 与突触形成相关;缝隙连接蛋白亚单位 connexin43 参与细胞间的信号传递;GPLD1 可能参与调节 GPI 锚定蛋白的功能。 GPLD1 在 OECs 表达可能有利于裂解抑制轴突生长的 GPI 锚定蛋白,通过消除这 些蛋白的抑制作用来促进轴突再生。phr1、hlf 和 Gja1(connexin43)则可能参与 OECs 与轴突之间的信息交流和调控,影响轴突的生长。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329

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