斯氏按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系及信号调控机制研究

【摘要】：黑化包裹是按蚊抗疟原虫的一种特异的防御机制,可能是疟原虫表面分子与可溶性模式识别受体结合而触发,并激活丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)级联,最终导致前酚氧化酶(PPO)的分解激活酚氧化酶(PO),PO和其它蛋白质发生交联而黑化包裹疟原虫。但还不知道PPO是如何到中肠组织内的,如何发生蛋白酶级联的,以及如何参与雌按蚊内疟原虫卵囊黑化过程的。疟原虫在按蚊中肠内外经历了配子体、合子、动合子和卵囊4个阶段,卵囊成熟后,子孢子逸出最后到达唾液腺而发育为感染期。斯氏按蚊是约氏疟原虫的易感媒介,卵囊很少黑化,本文利用斯氏按蚊吸饲硝喹乙酸盐(Nitroquine acetate,NA)诱导产生约氏疟原虫卵囊黑化模型,在血细胞或中肠差异表达的黑化相关蛋白或基因分析基础上初步探讨诱导黑化及其信号调控机制。 1.我们利用光镜和透射电子显微镜观察到用药诱导后的约氏疟原虫卵囊黑化颗粒,中肠代谢和超微结构异常改变,细胞间隙增宽。 2.利用Bradford法测定不同食源条件下斯氏按蚊雌蚊血淋巴和中肠蛋白浓度差异。统计学分析发现,NA组血淋巴蛋白浓度显著下降,而IB和NA组间中肠蛋白浓度无显著性差异。 3.血淋巴SDS-PAGE显示NA、IB、NB和S组均可见到数十条蛋白带,分子量在160kDa和66kDa蛋白差异非常明显,吸正常血及感染1d后66kDa蛋白表达增加,感染6～8d稍减弱,用药1、2d稍增强,3d开始下降。而160kDa蛋白在吸正常血及感染1d后呈上调表达,以后减弱。 4.对NA和IB组血淋巴和中肠蛋白进行2-DE和考马斯亮蓝染色,然后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的肽质量指纹图谱从15个血淋巴差异蛋白中初步鉴定出一种SP。利用抗冈比亚按蚊SP22D和PPO抗体进行Western印迹发现在NA和IB组蚊存在SP22D和PPO蛋白,约氏疟原虫感染后斯氏按蚊血淋巴SP22D和PPO表达增强,至6d达到峰值,在NA处理卵囊黑化过程中表达逐渐下降,但是黑化后斯氏按蚊中肠PPO含量呈现上升趋势。2-DE和Western印迹提示雌斯氏按蚊成蚊血淋巴内存在PPO和SP22D基础性表达,PPO和SP22D在体时可能均是以二聚体形式存在。 WP=14 约氏疟原虫感染后,雌斯氏按蚊成蚊血淋巴内PPO和SP22D水平是上升的,约氏疟原虫卵囊黑化后二者呈现下降表达,而中肠内PPO却升高。2-DE及PMF发现,用药后中肠糖代谢、结构和细胞信息联系等蛋白表达水平下降。 5.利用PPO和SP兼并引物和RT-PCR技术,成功地从斯氏按蚊雌成蚊全蚊、血淋巴或中肠内克隆到差异表达PPO1、SP1 和SP2基因,三基因均呈现基础性表达,但是吸正常鼠血、约氏疟原虫感染血或用药诱导卵囊黑化后表达水平上表现不同程度的差异,吸正常鼠血、感染血或用药后SP1,PPO1和SP2表达均上调,尤其感染及用药后更明显。ISH进一步证实PPO1、SP1 和SP2均表达于血淋巴和中肠细胞内。 6.在约氏疟原虫感染及黑化期间,转录因子Relish也随斯氏按蚊食源的不同而发生基因转录水平的变化。吸正常小鼠血24h Relish转录呈轻微上调,吸感染血6h、12h、24h或48h的Relish表达均明显增加,吸感染血5d和6d的Relish表达逐渐下降而趋近吸糖水水平,然而,吸NA糖水12h或24h的Relish表达呈中等水平增加。 研究结果表明,PPO和SP两种蛋白酶是约氏疟原虫卵囊黑化通路中重要的成分,可能同时在参与卵囊黑化包裹反应中发挥了重要作用。从时相点分析,Relish转录因子很可能参与PPO级联的转录调控。NA导致约氏疟原虫和/或斯氏按蚊中肠上皮细胞的化学损伤可能是黑化的始动原因,可能抑制约氏疟原虫蛋白或/和斯氏按蚊中肠蛋白的合成,干扰了疟原虫的正常发育,致使疟原虫逃避按蚊免疫反应的能力受到减弱或者按蚊识别结构变化疟原虫的能力增强,血淋巴和/或中肠PPO级联成分便参与黑化过程。