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《第三军医大学》 2004年
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姜黄素Ⅲ脂质体制备及其对肺癌细胞A549生物学特性的影响

宫亮  
【摘要】:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中80%以上是非小细胞肺癌(NSCLC),对放疗、化疗的敏感性差。肿瘤的生长、复发和转移是影响患者预后的主要因素。 姜黄色素是我国传统中药姜黄的主要活性成分,包含姜黄素I(姜黄素)、姜黄素II(脱甲氧基姜黄素)和姜黄素Ⅲ(双脱甲氧基姜黄素)3种单体。近年研究表明,姜黄色素可影响肿瘤发生、发展的各个阶段(始发、促进和演进),并可通过抑制血管生成抗肿瘤的侵袭和转移,其中以姜黄素Ⅲ的抗癌活性最强。作为一种有良好发展前景的抗癌药物,目前姜黄色素在肿瘤预防和治疗方面的作用已经引起人们的重视,成为研究热点。 但是,姜黄色素难溶于水,在体外也容易被氧化,难以进行静脉给药,目前也没有稳定性较好的药物剂型,口服的姜黄素大部分也在胃肠道内被代谢而失活,被吸收到血循环中的量很少。由于上述原因,为姜黄素的临床应用,特别是在肺癌等非胃肠道肿瘤治疗中的使用带来了一定的难度。 脂质体包裹技术可解决脂溶性药物不易溶于水的难题,提高易氧化药物在体内外的稳定性,降低被包封药物的毒性,增加药物被增殖旺盛的癌细胞的摄取量,因此是抗肿瘤药物的理想载体。鉴于此,本课题应用脂质体来包裹抗癌活性最强的姜黄素Ⅲ单体,并以肺腺癌A549细胞作为研究对象,旨在探讨以脂质体作为载体制成能适合于静脉使用的姜黄素新剂型的可能性,并进一步了解其对肺腺癌细胞生物学特性的影响,为姜黄素在肺癌治疗当中应用的深入研究提供一定实验基础。 方法: 姜黄素Ⅲ脂质体制备及大鼠体内药代动力学实验 1.姜黄素Ⅲ单体提取与脂质体制备 采用乙醇提取,硅胶柱层析、丙酮纯化的方法提取和分离姜黄色素单体,获得所需要的姜黄素Ⅲ,以乙醇注入法制备姜黄素Ⅲ脂质体,检测脂质体的包封率、粒径大小和初步稳定性。 2.姜黄素Ⅲ脂质体在大鼠体内药代动力学初步研究 WP=9 比较姜黄素Ⅲ脂质体和游离姜黄素Ⅲ注射液在大鼠体内的药代动力学,了解改变剂型后姜黄素Ⅲ脂质体在血药代动力学参数上的变化,探讨以脂质体为载体后,姜黄素Ⅲ静脉应用的可能性。 (二) 姜黄素Ⅲ脂质体对人肺腺癌细胞A549生物学特性的影响 1. 姜黄素Ⅲ脂质体对A549细胞的增殖影响 通过形态学观察、MTT试验、流式细胞仪检测等研究加入姜黄素Ⅲ脂质体作用后,体外培养的A549细胞增殖活性和细胞周期的改变。 2. 姜黄素Ⅲ脂质体诱导A549细胞凋亡的实验研究 丫啶橙染色,原位缺口末端标记检测,透射电镜进一步观察姜黄素Ⅲ脂质体对A549细胞凋亡和坏死的影响,RT-PCR在mRNA水平检测bcl-2基因的表达。 主要实验结果: 1. 经乙醇提取→石油醚脱脂→硅胶柱层析→丙酮纯化的途径提取和分离姜黄素活性单体效果良好,操作简便,并具有可重复性。 2. 经优化后的乙醇注入法为制备的最佳方法,获得的姜黄素Ⅲ脂质体平均包封率为87.89%,平均粒径为130.5nm,粒径分布均匀。药物溶解度明显增加,体外稳定性明显增加。 3. 大鼠体内药代动力学结果表明,姜黄素Ⅲ脂质体静脉注射后消除半衰期为游离姜黄素Ⅲ注射液的1.22倍,AUC为1.95倍,清除率为0.5倍。提高注射浓度后,游离姜黄素Ⅲ因为溶解性差造成动物注射后即刻死亡明显增加,而姜黄素Ⅲ脂质体在增加10倍注射浓度后动物无一死亡,注射安全性显著改善,且血药浓度可明显提高,AUC增加为13.58倍。 4. 姜黄素Ⅲ脂质体和游离姜黄素Ⅲ均可对体外培养的A549细胞增殖活性产生明确影响(p0.05),有剂量依赖性,其IC50值分别为12.108 ug·ml-1和16.989ug·ml-1。流式细胞仪检测细胞周期主要被阻滞在S期。空白脂质体与阴性对照比较差异不显著(p0.05)。 5. 姜黄素Ⅲ脂质体促进A549细胞死亡可能包含诱导凋亡和促进坏死两种方式,15 ug·ml-1浓度时出现明显凋亡,20 ug·ml-1浓度以上则以坏死为主。 6. RT-PCR结果表明姜黄素Ⅲ脂质体和游离姜黄素Ⅲ作用后,A549细胞抗凋亡基因bcl-2在mRNA水平的表达均受到抑制,有一定剂量依赖性。 结论: 1.选择脂质体作为姜黄素Ⅲ单体的药物载体是可行的,包封率高,药物溶解度和 WP=10 体外稳定性明显增加。 2.脂质体包裹姜黄素Ⅲ后,其静脉注射安全性得到显著改善,注射后血药浓度及曲线下面积均明显增加。脂质体剂型的制备有望解决姜黄色素不易静脉给药的难题,使实现姜黄素Ⅲ静脉应用并达到有效血药浓度成为可行。 3.制备的姜黄素Ⅲ脂质体对体外培养人肺腺癌细胞A549的生物学特性有明确的影响,①可抑制细胞的恶性增殖,并阻滞细胞周期在S期,② 诱导细胞凋亡和促进细胞坏死。姜黄素Ⅲ脂质体的作用与阴性对照比较差异显著,与游离姜黄素Ⅲ比较其抑制活性没有减弱,表示其有可能在肺癌的治疗中发挥作用。 4.姜黄素Ⅲ脂质体和游离姜黄素Ⅲ作用后均可抑制bcl-2基因在mRNA水平的表达,这可能是其诱导A549细胞凋亡的机制之一。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R734.2

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【引证文献】
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【参考文献】
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3 陈敏娟;姜黄素静脉给药剂型的制备与其抗癌学活性及药代动力学的研究[D];福建医科大学;2003年
4 魏小娣;姜黄素对新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的疗效评价及其机制的研究[D];重庆医科大学;2010年
5 安伟;姜黄素对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D];山东大学;2010年
6 孙玉;依那普利联合姜黄素对实验性肝纤维化小鼠肝脏的保护作用及机制[D];河北医科大学;2010年
7 陈玲玲;凋亡诱导因子在姜黄素诱导的大鼠肺成纤维细胞凋亡中的作用[D];南京医科大学;2011年
8 王晓露;姜黄素衍生物FM0807的部分理化性质及抗肿瘤活性研究[D];福建医科大学;2011年
9 林燕芳;姜黄素前体药物FM0806的体内外稳定性及其抗肿瘤活性研究[D];福建医科大学;2009年
10 张秀红;依那普利联合姜黄素对防治小鼠肝纤维化效果及机制研究[D];河北医科大学;2010年
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