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《第三军医大学》 2004年
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肾上腺髓质素对低氧和转化生长因子β1促成纤维细胞增殖、胶原合成的影响及机制

郝淑玲  
【摘要】:低氧性肺动脉高压(HPH)是慢性肺源性心脏病发病的中心环节。低氧引起肺血管构型重建(PVSR)是导致慢性、持续性肺动脉高压的重要原因。血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖及基质成分如胶原蛋白的增多与沉积,是其中主要的病理变化。成纤维细胞是产生基质的主要细胞。因此,成纤维细胞的增殖和胶原合成的增加是PVSR的重要发病因素。与成纤维细胞增殖和胶原代谢有关的细胞因子很多,转化生长因子β(TGF-β)与合成胶原等结缔组织关系最为密切。TGF-β1可以刺激成纤维细胞合成胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖等细胞外基质成分,也能够刺激成纤维细胞增殖。细胞内游离钙离子([Ca~(2+)]i)是细胞内信号转导系统的重要组成部分,作为细胞外/内信息传递中起中介作用的第二信使物质,[Ca~(2+)]i浓度的变化直接影响诸如细胞运动、电兴奋、增殖等生理功能的改变。 肾上腺體质素(Adrenomedulkiln,ADM)是日本学者1993年发现的一种血管活性肽,具有舒张血管、降低血压、保护上皮、调节炎症等多种生物学作用。研究发现,成纤维细胞是ADM的靶细胞。本研究小组在以往承担的国家自然科学基金课题《低氧时肺血管肾上腺體质素分泌调控的细胞分子机制》(项目批准号:39770342)的研究表明,肺心病急性期和稳定期患者血浆ADM明显高于正常对照组,慢性低氧性肺动脉高压大鼠血浆ADM显著高于平原对照组,提示ADM与低氧性肺动脉高压关系密切。 目的 本实验是在本研究小组以往工作的基础上,进一步研究ADM与低氧性肺血管结构改建的关系。以体外培养的人胚肺成纤维细胞为靶细胞,以低氧(2%O_2)为刺激因素,观察:1、常氧和低氧后成纤维细胞ADM蛋白表达的变化;2、低氧对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及ADM对其作用;3、低氧对成纤维细胞产生厂GF-β1的作用;4、ADM对7GF-β1的拮抗作用;5、ADM对低氧引起的成纤维细胞TGF-β1合成和[Ca~(2+)]i变化的调节作用,以期阐明ADM在低氧性肺血管结构改建过程中可能发挥的作用及其发生机制,为研究防治低氧性肺动脉高压的途径提供新的思路和实验依据。 方法 1、采用体外细胞培养方法,培养并鉴定人胚肺成纤维细胞,建立人胚肺成纤维细胞低氧(2%O_2)模型。2、光、电镜下观察低氧(2%O_2)对成纤维细胞形态和 第:军医大‘学不吹卜学位论义 结构的影响。3、采用免疫组织化学(Sl,)方法,观察常氧和低氧(2%02)后成纤维细 胞ADM蛋白表达的变化。4、采用细胞计数、四氮畔盐(MTT)法、3H一脯氨酸掺入法, 分别观察低氧(2知2)和TGF一pl对成纤维细胞增殖及胶原合成与分泌的作用及ADM 对其影响。5、采用双抗体夹心ELISA法检测成纤维细胞培养液中1’(;F一pl蛋白水平。 6、采用激光扫描共聚焦显微镜技术动态观测低氧时成纤维细胞「CaZ了i的变化及AI)M 对其影响。 结果l、原代培养人胚肺成纤维细胞,免疫组化染色a一actin阴性,证明本实 验所培养的细胞是成纤维细胞。细胞传至第6代,台盼蓝染色活细胞数95%,表明实 验用细胞仍保持较好活力。2、低氧(2知2)后,成纤维细胞胞浆内粗面内质网、核糖 体数量明显增多,内质网扩张。3、常氧和低氧24h、48h组成纤维细胞胞浆内A服蛋 白均呈不同程度的阳性表达,低氧组成纤维细胞胞浆内ADM棕色颗粒浓密,呈中度阳 性和强阳性。4、低氧24h、48h、72h均明显促进成纤维细胞增殖和胶原合成与分泌, 与对照组比较,差别均有非常显著性意义(尽0.01)。低氧各组加入A叭后,成纤维细 胞增殖和胶原合成与分泌受到抑制(尸0 .05),以ADMlo一7mol/L组抑制作用最明显。5、 TGF一pl(sng/ml)可以促进成纤维细胞增殖和胶原合成与分泌(尸0 .01),ADM能够 抑制TGF一pl的促成纤维细胞增殖和促胶原合成作用(尸0 .05)。6、低氧使成纤维细 胞培养液中TGF一pl蛋白水平增加,ADM(10一7,ol/I,)组TGF一pl含量较对照组下降 (尽0.05)。7、在激光扫描共聚焦显微镜一下,观察到低氧(2%02)促进成纤维细胞【caz+」i 升高,这种作用主要是通过促进成纤维细胞外Ca2+内流引起的,ADM可以抑制低氧引起 的[CaZ+」i升高。 结论1、体外培养的人胚肺成纤维细胞可表达ADM蛋白,表明肺成纤维细胞是产 生ADM的来源之一;低氧可以促进肺成纤维细胞ADM合成。2、低氧(2叨2)可诱导肺 成纤维细胞增殖、胶原合成和分泌增加,这可能是低氧引起肺血管结构改建的重要机 制之一。3、A服可以抑制低氧和TGF一pl引起的肺成纤维细胞增殖和胶原合成,提示 ADM具有抑制低氧和TGF一pl的促肺血管重塑效应。4、抑制低氧引起的【CaZ‘」i增加和 抑制TGF一pl合成是ADM抑制低氧性肺血管重塑的部分作用机制。 ADM具有抑制低氧性肺成纤维细胞增殖和胶原合成的作用提示,ADM是一种有效的 抗低氧性肺血管重塑因子,它可能通过拮抗肺血管异型重构,在缓解肺动脉压力升高 中发挥代偿性保护调节作用,这为低氧性肺动脉高压的防治提供了新的途径和实验依 据,展示出潜在的临床应用前景。
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