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《第三军医大学》 2004年
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骨髓间充质干细胞对雌性大鼠压力性尿失禁影响的研究

胡华  
【摘要】:压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是指患者腹压突然增加(咳嗽、大哭、喷嚏、体举重物)时,尿液不自主地由尿道口流出的现象。目前女性发病率约为15%-60%,是影响女性尤其是中老年女性生活质量的主要疾病之一,特别是在我国,随着人口进一步老龄化,SUI越来越受到人们的重视。 目前对于SUI的治疗主要涉及两大方面:非手术治疗以及手术治疗。非手术治疗主要是通过体育锻炼、生物反馈、药物治疗等手段改善病情,适用于症状较轻的患者及年轻女性,使用范围较窄。手术治疗主要包括经阴道尿道膀胱颈筋膜缝合术、经耻骨后膀胱尿道悬吊术、无张力阴道悬带术等。手术疗效较好,然而诸如病人的选择、手术技巧、病变情况等因素都直接影响手术治疗效果, 同时手术创伤大,且手术中悬吊力度不易掌握,易出现矫枉过正,发生尿储留。近几年,注射治疗以其安全、简单、方便、创伤较小,在门诊即可施行的优点日渐引起了人们的重视,它是将药物或化学制剂注射到后尿道或膀胱内口周围粘膜下及肌层中,使尿道腔变窄、拉长和缩小,从而提高尿道阻力,关闭尿道内口,以有效控制尿流。 目前在注射治疗中远期疗效好、花费成本较少、安全的组织材料仍待发现。理想的填充试剂应具有低免疫原性、无毒性、较低过敏原性、有效性、与局部解剖结构相一致性且注射后与局部组织相结合只有很轻微的炎症等特点。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能较好的满足以上要求,其具有向成肌细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞及神经细胞等多种细胞分化的潜能,且来源丰富,可在体外分离、培养及扩增,具有较好的同种异体免疫反应调节能力,是一种良好的替代治疗靶细胞。利用MSCs及其向成肌细胞方向分化的细胞进行注射治疗,具有安全、免疫排斥性小、低过敏原性等优点,相信在不远的将来可能会为压力性尿失禁提供新的治疗机会。 本研究通过将MSCs及经5-Aza-CR诱导后的MSCs注射到压力性尿失禁大鼠的后尿道以及膀胱内口周围粘膜下及肌层中,采用喷嚏负荷试验及尿动力学检查等方法研究以上述两种细胞为介质的注射治疗对雌性大鼠SUI的影响。主要实验方法及结果 WP=9 如下: 一、MSCs分离培养的研究: 1.胎牛血清浓度的选定:分别选用含0%、5%、10%、15%和20%胎牛血清浓度的完全培养基,以MTT比色法分析不同血清浓度下MSCs生长增殖情况,发现10%和15%血清浓度比较适合MSCs生长。 2.MSCs接种浓度的选定:分别以2、4、6、8、10、12、14、16×105个/ml的密度接种MSCs,以MTT比色法分析不同接种密度下MSCs生长情况,发现以(8-10)×105个/ml的密度接种MSCs,其生长繁殖情况最好。 3.原代MSCs形态观察:MSCs细胞均匀散在分布,部分呈克隆样生长,细胞形态以杆状及梭状为主,少数形态不规则。 4.MSCs传代细胞的观察:传代细胞经过了滞留期、指数增长期及平台期,传1-4代的MSCs生长增殖较快、活性较好,并且形态较均一,传5-10代的MSCs,生长增殖变慢,且形态开始变化,呈多角形、分叉状,传1-4代的MSCs期细胞可用于诱导、注射治疗的研究。 二、MSCs向成肌细胞诱导分化的研究; 1.诱导浓度的选定:分别选用0、1、3、5、10及20μmol/L浓度的5-Aza-CR作用于MSCs, 以MTT比色法分析不同浓度5-Aza-CR诱导后MSCs的增殖情况。结果发现5或10μmol/L浓度的5-Aza-CR为诱导MSCs分化增殖的最佳浓度。 2.成肌相关蛋白的检测:10μmol/L 5-Aza-CR诱导MSCs 8d后,部分MSCs开始表达desmin,15d后表达明显增强;诱导后11d,部分细胞开始表达myosin,19d表达明显增强。 3.诱导后细胞形态观察:通过10μmol/L 5-Aza-CR诱导传两代的MSCs,7d后发现长的多核细胞;10d后胞体增大,呈粗杆状;15d时有肌管样结构出现。 三、注射诱导前后的MSCs对雌性大鼠SUI影响的研究: 1.大鼠SUI模型的建立:以气囊扩张产后大鼠阴道的方法,模拟第二产程延长时胎头对骨盆底以及下尿道的压力,通过喷嚏负荷实验、尿动力学检查证实大鼠有SUI的发生。 2.细胞注射对大鼠SUI的影响:将诱导前后的MSCs注射到大鼠模型后尿道或膀胱内口粘膜及肌层中,通过喷嚏负荷实验、尿动力学检查发现注射后大鼠最大膀胱容积增大,最大逼尿肌压及喷嚏负荷实验阳性率下降,注射前后有显著性差异。 WP=10 本实验对MSCs进行了成功地分离和诱导,通过喷嚏负荷实验及尿动力学检查证实以诱导前后MSCs为注射介质的细胞治疗为雌性大鼠SUI提供了一种有效的治疗方法,同时,也为将来应用于女性SUI的治疗奠定了一定的实验基础。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R694

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