山羊卵母细胞冷冻保存及其效果的研究

【摘要】：由于目前对山羊卵母细胞冷冻保存的研究较少,并且效果很差,加之山羊体外受精技术还很不成熟,影响了发育调控机理和转基因胚胎工程等方面的研究与应用。鉴于此,本实验首先优化了山羊卵母细胞体外成熟体系,同时建立了卵母细胞冷冻保存方案,并应用体外受精和胚胎移植技术评价冻存卵母细胞的发育潜能,提出了一套优化的培养液和操作技术体系。为卵母细胞种子库的建立和即将开展的转基因山羊乳腺生物反应器的研究提供技术平台。 本实验选用抽吸法从卵巢表面Φ2mm 卵泡中收集可用卵母细胞作为实验材料。繁殖季节和非繁殖季节从屠宰场采集卵巢243 个和997 个,分别回收可用卵母细胞1062 个和2853 个,平均单个卵巢卵细胞数为4.37 枚和2.86 枚,二者差异不显著(p0.05)。 在卵母细胞成熟培养实验中,从模拟体内发育成熟的微环境出发,比较研究了生殖激素、GFF、血清和EGF 等成分对卵母细胞体外成熟发育的影响。发现10ug/ml FSH +10ug/ml LH+1ug/ml E_2 激素组优于其它组,成熟率最高(60.0%),退化率显著性最低(14.7%);含GFF 组第1 极体释放率显著(p0.05)高于对照组,分别为42.3~45.7% vs. 22.4~25.0%;含EGF 组成熟率均明显(p0.05)高于对照组(71.6~76.2% vs. 56.4%),不同浓度EGF 组间无统计差异;巯基乙醇对卵母细胞成熟无明显影响。结果表明,生殖激素、GFF、和EGF 对卵母细胞的核质成熟均具有不同程度的促进作用。 根据上述实验结果,我们建立了优化的山羊卵母细胞体外成熟体系:来源于卵巢上Φ2mm 卵泡的A 级和B 级卵丘卵母细胞复合体在M199+10ug/ml FSH+10ug/ml LH+1ug/ml E2+10%EGS+50%GFF+50ng/ml EGF+100umol/L CYS 中培养27 h,成熟率超过70%。 选择合适的冷冻保护剂种类、浓度与组合是卵细胞冷冻保存成功的关键。因此,我们首先将GV 期卵母细胞与不同浓度的冷冻保护剂溶液作用20min,然后检测了卵母细胞的存活率。结果表明,10%冷冻保护剂溶液对卵母细胞的毒性较小,但毒性随浓度和温度的升高而增强,4 种冷冻保护剂对山羊卵母细胞的毒性强弱顺序为GLDMSOPROH≈EG。