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《第三军医大学》 2004年
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无创性产前诊断遗传性疾病的生物芯片的研究

朱前勇  
【摘要】:目的:我们的目标是:建立具有实用价值的无创性产前诊断遗传病的生物芯片微型全分析系统,拟将胎儿有核红细胞的富集,胎儿遗传物质的扩增和遗传病诊断三个部分有机组合,实现整个分析过程的自动化、微型化,从而减少资源浪费和避免结果的污染。现阶段我们结合无创性产前诊断仅对样本制备、生化反应、结果诊断三个独立环节进行初步的研究和优化,具体目的是:1.样本制备方面,尝试在提高自孕妇外周血中富集胎儿细胞效率的同时,绕过仪器微型化中最难克服的离心问题,使胎儿细胞的富集过程易于实现自动化和微型化;2.生化反应方面,以非微加工形式构建芯片PCR的反应腔体,降低制作成本,使其与温控系统整合后更利于普及应用;3.结果检测方面,拟构建固相PCR(solid phase-PCR,SP-PCR)诊断芯片,并对芯片的构建条件进行系统优化。最终,以缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)为模型,初步建立无创性产前诊断生物芯片的技术平台。 方法: 1.建立孕妇外周血胎儿有核红细胞的高效富集系统:首先,建立孕妇外周血实验模型,以此模型确定合适的红细胞凝集剂浓度,比较抗体CD50和CD45在去除白细胞和富集有核红细胞(nucleated red blood cells,NRBC)方面的差异。然后,采用合适浓度的红细胞凝集剂和CD50抗体去除孕妇血中的白细胞和成熟红细胞,再用微加工制作的微型硅膜过滤芯片,以细胞直径的差异,进一步去除红细胞得到胎儿有核红细胞。最后,分别用模拟孕妇外周血和真实孕妇外周血比较新建方法和常用方法对NRBC的富集效率和白细胞/红细胞的清除率。 2.实现胎儿单细胞芯片全基因组扩增:借鉴原位PCR的密封圈和芯片实验室常用的玻片构建PCR芯片反应腔体,验证构建的腔体与PCR的材料相容性。利用优化的表面处理剂BSA浓度和所加酶量等条件确定扩增的检测底限。凝胶纯化后测定芯片单细胞全基因组的扩增产量,并以此为模板进行多种基因的再次扩增,初步验证产物的均匀性和可用性。 3.构建缺失型DMDSP-PCR诊断芯片:构建SP-PCR诊断芯片,利用人工合成的寡核苷酸进行原理验证实验;并对构建芯片片基上探针的耐热性、点样探针浓度、探针连接臂长度和探针固定的紫外交联强度等因素进行系统优化和选择。以缺失型DMD
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R714.5

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