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《第三军医大学》 2007年
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白鲜皮抗内毒素的物质基础及其作用机制研究

郭毅斌  
【摘要】: 一、背景 脓毒症(sepsis)是感染引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是严重烧伤、创伤、感染、休克和大手术等后常见的并发症,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官系统功能障碍综合征(MODS)等,目前已成为临床危重患者的主要死亡原因之一。大量研究表明,革兰阴性(Gram-negative,G-)菌的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是介导脓毒症的主要启动子,LPS经通过活性中心类脂A(lipid A)与相应受体TLR4(Toll like 4,TLR4)结合,诱导炎症反应细胞合成与释放多种炎症介质(如TNF-α、IL-1和IL-6等),介导脓毒症的发生。尽管对脓毒症的病理生理及防治策略已进行较为深入的研究,但迄今为止临床上尚无特殊有效的治疗措施。由于LPS的胞内信号转导极为复杂,LPS诱发的细胞活化及细胞因子级联效应一旦启动将不易控制。因此,阻断LPS的活性中心lipid A与其受体的结合是防治脓毒症的关键。 中医中药是我国巨大的资源宝库,中医药在治疗脓毒症方面具有悠久历史。研究表明,多种中药具有抗菌、抗LPS作用,国内外研究也表明,来自天然的先导化合物中很有希望得到治疗疑难病症的新药,从天然化合物筛选得到的有效单体的命中率比合成化合物高。因此,如果能够从中药分离制备到与LPS作用的有效物质/单体,对开辟新的拮抗LPS措施具有重要意义。但由于中草药的化学组成多而复杂,其抗LPS作用的物质基础一直未得以阐明,其原因主要与中药单体研究中抗LPS靶点不明确及对活性组分无法及时跟踪检测有关。 因此,本研究采用生物传感器技术,将LPS的生物活性中心lipid A包被于生物传感器疏水样品池,使lipid A结构上发挥重要生物学作用的亲水端外露,以此作为中药抗LPS活性组分筛选、跟踪和检测的靶点,从60种中药中选择出与lipid A亲和力较高的中药白鲜皮作为研究对象,结合传统的中药分离技术及高效液相色谱(high performance liquid chromatogram,HPLC)等方法,从白鲜皮水煎液中获得抗LPS的活性物质进行体外内抗LPS的活性研究。 二、目的 从中药白鲜皮中分离提取具有拮抗LPS活性的物质并研究其作用机制。 三、材料与方法 1.应用lipid A为靶点的生物传感器技术平台,观察60种中药水煎液与lipid A的结合反应;以白鲜皮水煎液为研究对象,通过大孔吸附树脂、正丁醇萃取、聚酰胺柱层析和HPLC,分离提取其中与lipid A的高亲和力结合的组分或产物;动态浊度法鲎试验检测HPLC分离产物DPR1~4对LPS的中和活性;通过质谱、红外光谱和核磁共振谱对其中的活性物质DPR-2进行结构分析。 2.应用生物传感器技术平台,观察DPR-2与lipid A的结合作用并计算二者的平衡解离常数(Kd)值;动态浊度法鲎试验测定DPR-2对LPS的中和能力;激光扫描共聚焦显微镜(LSM)观察不同浓度DPR-2(0、8、16、32、64μg/ml)下异硫氰酸荧光素标记LPS(FITC-LPS,100 ng/ml)与小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞结合的荧光强度;免疫细胞化学法观察DPR-2干预后LPS(100 ng/ml)诱导的RAW264.7细胞TLR4的表达;采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和ELISA法检测DPR-2干预后LPS(100 ng/ml)刺激的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6 mRNA的表达及细胞因子TNF-α和IL-6的分泌;MTT法检测DPR-2对RAW264.7细胞活力的影响。 3.采用尾静脉注射LPS制备小鼠脓毒症和内毒素血症(endotoxemia,ETM)模型;观察DPR-2对致死剂量LPS攻击小鼠的保护作用;观察DPR-2对ETM小鼠的治疗作用:伤后2、6、12、24、48和72 h采集血和肝、肺组织标本,动态浊度法鲎试验检测血浆LPS水平;ELISA法检测血浆TNF-α、IL-6水平;Real-time RT-PCR检测肝、肺组织的TNF-α和IL-6 mRNA表达;常规HE染色观察肝、肺的病理学变化。 四、结果 1.大黄、青果、赤芍、白鲜皮等4种中药水煎液与lipid A具有较高的特异性结合能力(RU300 arc seconds)。从白鲜皮中提取活性物质DPR-2,结构分析可能是一种分子量为709的四糖化合物。 2. DPR-2与lipid A具有较高的亲和力,其Kd值为8.63×10-6M,DPR-2体外对LPS具有中和作用。DPR-2可抑制FITC-LPS与小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞膜受体结合,并对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α及IL-6在蛋白及基因表达水平均具有抑制作用并呈剂量效应关系。DPR-2在体外实验浓度对细胞活力无影响。 3. DPR-2对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用,可降低ETM小鼠的血浆LPS、TNF-α及IL-6水平,减弱肝、肺组织的TNF-α及IL-6 mRNA表达,并减轻ETM小鼠重要器官肝、肺的病理学损伤。 五、结论 本论文采用生物传感器技术,以LPS的生物活性中心lipid A作为筛选、跟踪中药活性组分或物质的靶点,结合传统的中药分离技术及HPLC等方法,从筛选出的中药白鲜皮中分离获得高亲和力结合lipid A的活性物质DPR-2(分子量为709的四糖化合物),研究表明DPR-2对LPS攻击小鼠具有保护作用,其机制可能与DPR-2的拮抗LPS活性有关,而DPR-2与lipid A的高亲和力结合活性可能是其体内外拮抗LPS活性的重要基础。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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【引证文献】
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【同被引文献】
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