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《第三军医大学》 2007年
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人恶性胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞功能性甲酰化肽受体(FPR)促血管生成作用

姚小红  
【摘要】: 恶性实体瘤(malignant solid tumors)的生长和转移依赖于肿瘤内血管生成(angiogenesis)。因此,血管生成机制和抗血管生成一直是近些年肿瘤研究领域和前沿之一。人脑恶性胶质瘤血管生成十分活跃,且微血管密度越高,患者预后越差。所以,以胶质瘤为模型研究肿瘤血管生成机制和抗血管生成治疗方法。 人们已经认识到,瘤细胞通过分泌大量血管生成因子刺激内皮细胞增殖、迁移和管型形成而诱导肿瘤血管生成。在这一过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)是重要的促血管生成因子。越来越多的证据表明,G-蛋白偶联的趋化因子受体在肿瘤的生长和血管生成中具有重要作用。本课题组前期研究发现,G-蛋白偶联的甲酰化肽受体(formylpeptide receptor, FPR)与胶质瘤级别和微血管密度密切相关,即它可能具有促进肿瘤生长和血管生成的功能。但其促血管生成作用机制和治疗学意义尚需探讨。 近年发现,肿瘤中存在少量具有自我更新、多潜能和启动与重建肿瘤组织表型能力的细胞,即肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)。这些干细胞是否参与血管生成缺乏研究。直到最近有报道,胶质瘤干细胞在缺氧条件下可生成VEGF,提示其参与血管生成,但详细机制不清。由于近年来有报道某些正常干细胞表达FPR,我们推测,肿瘤干细胞可能也表达FPR并介导血管生成。 为了进一步了解FPR在胶质瘤细胞生长和血管生成中的作用及其机制,我们分别对人恶性胶质瘤细胞系U87及其中的CD133+胶质瘤干细胞表达的FPR在血管生成中的作用进行了研究,并对FPR是否可能成为胶质瘤抗血管生成治疗的新靶点进行探索。首先,我们检测了人恶性胶质瘤细胞系U87中FPR的表达及其活化后促细胞增殖和血管生成因子产生的作用,观测我室自行合成的抗癌化合物诺帝(Nordy)对FPR所介导的上述效应的抑制作用;然后,我们对U87细胞中具有干细胞特性的细胞进行分离、培养和鉴定;最后,我们研究了从U87细胞内分离得到的具有干细胞特性的胶质瘤干细胞及其表达的功能性FPR在血管生成中的作用。主要结果和结论如下: 1.人恶性胶质瘤细胞系U87表达功能性FPR,活化后介导细胞增殖及VEGF和IL-8产生。采用免疫荧光染色法检测U87、FPR-siRNA-U87 (FPR基因的siRNA质粒载体转染入U87细胞内以干扰FPR在U87细胞的表达)和FPR-mock-U87细胞(将空质粒载体转染入U87细胞) FPR的表达情况,结果显示,U87和FPR-mock-U87细胞均表达FPR,而绝大多数FPR-siRNA-U87细胞不表达FPR,仅处于分裂期的细胞表达FPR。采用MTT、ELISA和RT-PCR法检测人恶性胶质瘤细胞系U87的FPR活化后的效应,结果显示:①U87和FPR-mock-U87细胞的fMLF刺激组OD值均较对照组显著升高,P0.05;而FPR-siRNA-U87细胞的fMLF刺激组OD值在各时相点与对照组相比无明显差异(P0.05);②U87和FPR-mock-U87细胞fMLF刺激组VEGF、IL-8的mRNA水平和培养基上清中蛋白分泌量均较对照组显著升高(P0.05);FPR-siRNA-U87细胞fMLF刺激组VEGF、IL-8的mRNA水平和培养基中蛋白分泌量与对照组相比无显著差异(P0.05)。上述结果表明,人恶性胶质瘤细胞系U87表达功能性FPR,其活化后促进细胞增殖和血管生成因子VEGF和IL-8的产生和分泌。 2.自行合成的抗癌化合物诺帝对U87细胞FPR表达和活化后效应具有抑制作用。①100μmol/L诺帝处理12h和24h后,U87细胞FPR平均吸光度值(AOD)分别为(582.4±173.46)和(478.852±107.43),与对照组U87细胞(1332.1±275.26)相比有统计学意义(P0.01),②以100μmol/L诺帝和100nmol/L fMLF处理24h后,与对照组相比,U87细胞透亮度和折光性降低,细胞活力下降。MTT实验结果显示,诺帝对fMLF诱导的细胞增殖具有明显的抑制作用;③ELISA检测结果显示,诺帝处理组U87细胞的VEGF、IL-8的mRNA水平和培养基上清中蛋白分泌量均较对照组显著降低。上述结果表明,诺帝对人恶性胶质瘤细胞系U87的FPR表达和该受体活化后的促瘤细胞增殖及血管生成因子VEGF和IL-8的分泌具有抑制作用。 3.人恶性胶质瘤细胞系U87中存在具有增殖、自我更新和高成瘤能力的胶质瘤干细胞。①免疫荧光染色和流式检测结果显示,人恶性胶质瘤细胞系U87中包含有CD133+细胞,其比例为0.5%。②磁珠分选获得的CD133+细胞在干细胞培养基中可形成克隆性细胞球,CD133+细胞形成的细胞球表达神经干细胞的标志物nestin和CD133,不表达分化的星形胶质细胞标志物GFAP,而且CD133+细胞球在含血清的常规培养中可分化为贴壁细胞,形态与亲本U87细胞相似。③CD133+细胞在裸鼠体内成瘤能力明显强于CD133-细胞;且其增殖指数(PI%)显著高于CD133-细胞移植瘤(P﹤0.05);从形成的移植瘤组织中分离获得的细胞经流式细胞检测,CD133+细胞占5%,CD133+细胞移植瘤组织高表达nestin和vimentin,低表达GFAP,而CD133-细胞移植瘤组织低表达nestin和vimentin,高表达GFAP。④采用体内连续传代法检测显示,CD133+细胞移植瘤原代培养细胞形成的克隆性细胞球接种于裸鼠体内,可再次形成组织特征与CD133+细胞移植瘤相似的肿瘤。上述结果表明,人恶性胶质瘤细胞系U87中包含有具有体内成瘤、无限增殖和自我更新能力的胶质瘤干细胞。 4.胶质瘤干细胞高表达FPR,活化后具有促血管生成作用。①免疫荧光染色显示,CD133和G蛋白偶联受体FPR共表达于CD133+细胞形成的细胞球表面。②钙流检测结果显示,在细胞外无钙离子存在的条件下,10-4~10-7mmol/L fMLF与CD133+细胞G蛋白偶联受体FPR结合,使细胞内游离Ca2+升高。fMLF诱导的CD133+细胞荧光强度增强效应呈剂量依赖性,胞内[Ca2+]i流动包括一个上升过程、一个持续平台期及一个缓慢下降期。③ELISA检测显示,胶质瘤干细胞(CD133+细胞)自身能够分泌较多的VEGF。④将膜荧光染料CFSE标记的CD133+细胞移植入裸鼠体内后的结果显示,裸鼠皮下移植瘤新生血管(CD105标记)多位于CFSE标记的CD133+胶质瘤干细胞周围;免疫组化染色显示,移植瘤组织表达的VEGF及微血管密度(MVD)显著高于CD133-细胞移植瘤。⑤ELISA检测显示,10-4mmol/L fMLF可增加CD133+细胞VEGF蛋白分泌,与对照组相比(无fMLF刺激),具有显著性统计差异(P﹤0.05)。上述结果表明,U87细胞中存在的胶质瘤干细胞表达功能性FPR,其活化后可促进VEGF的分泌,VEGF在胶质瘤干细胞介导的血管生成中具有重要作用。 综上所述,(1)人恶性胶质瘤细胞系U87表达的FPR被激活后,具有促进细胞增殖以及血管生成因子产生和分泌的功能,诺帝对U87细胞FPR表达和该受体活化后的促瘤细胞增殖及血管生成因子的产生和分泌具有抑制作用;(2)人恶性胶质瘤细胞系U87细胞群体中存在少量具有增殖、自我更新和高成瘤能力的胶质瘤干细胞,并首次发现胶质瘤干细胞表达功能性FPR,活化后具有促血管生成作用。上述研究结果为恶性胶质瘤抗血管生成治疗提供了新的治疗靶点。
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