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《第三军医大学》 2007年
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人参皂甙Rg1、Rb1对神经干细胞增殖的影响及保护作用研究

石永江  
【摘要】: 人参(panax ginseng,PG)是我国传统的名贵中药,素有”百草药王”之美称,应用于中医临床已有两千多年的历史,研究证明人参有滋补、强壮、抗疲劳、扩血管、益智、抗癌等多方面的作用。 人参皂甙(Ginsenosides,GS)是人参的主要有效成分之一。人参皂甙属于三萜类皂甙,分为三类:一为人参皂甙二醇型,有人参皂甙Rb1,Rb2,Rc,Rd,Rh2等;二为人参皂甙三醇型,有人参皂甙Rg1,Re,Rf,Rg2,Rh1等;三为齐墩果酸型,有人参皂甙Ro,Rh3,Ri等;二醇型和三醇型(主要是Rb1和Rg1)在人参皂甙中占大多数,是人参的主要活性成分。 STATs是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子。配体依赖的STATs持续激活与细胞的分化、生长、增殖紧密相关。STAT3作为STATs家族成员之一,参与细胞的分化、增殖、凋亡等一系列生理功能的调控,Janus激酶信号转导子与转录激活子(Janus kinase signaltransducers and activators of transcription,JAK/STAT)细胞因子信号转导途径,广泛参与神经细胞的增殖、分化及衰老等过程。 神经干细胞(neural stem cells,NSCs)概念的提出,彻底改变了以往认为中枢神经不能再生的认识。NSCs广泛存在于哺乳动物的神经系统,其中侧脑室附近的室管膜前下区(Anterior subventricular zone,SVZa)被认为是哺乳动物神经系统中NSCs最为集中的部位之一。研究发现SVZa的NSCs产生后,逐渐向嗅球(Olfactory bulb,OB)迁移,是嗅球神经元终身更新的重要来源。NSCs在从SVZa迁移到OB的过程中形成一条高度局限的迁移通道——喙侧迁移流(Rostral migratory stream,RMS),位于迁移流中的神经干细胞保持增殖状态和神经干细胞特征而不进一步分化,迁移到嗅球后才进一步分化成熟。室管膜前下区神经干细胞独特的迁移途径和方式为研究神经干细胞分化调控机制提供了非常理想的模型。 由于伦理学等因素的影响而使NSCs供体来源受限;又由于NSCs增殖能力有限,使其应用受限,目前,在应用多种生长因子促进NSCs增殖方面的研究较多,但是这些生长因子成本高、不能越过血脑屏障、毒副作用多,大剂量全身用药受到限制,因此寻找价廉、低毒、易通过血脑屏障的小分子天然植物药,促进NSCs的增殖,将有重要的意义。从200多种中草药提取物中筛选出的人参皂甙Rg1和Rb1,对CNS神经细胞增殖、保护和抗凋亡有显著的作用。 本实验将观察人参皂甙Rg1和Rb1对SVZa NSCs增殖和保护作用,并对其机制进行初步探讨。 以E17天清洁级SD大鼠孕鼠SVZa NSCs为研究对象,采用SVZa NSCs的取材、原代培养和传代培养技术;将传1代NSCs分为三组(对照组、Rg1处理组、Rb1处理组),应用细胞计数法和MTT法检测各组NSCs增殖情况,用免疫细胞化学法检测各组增殖细胞STAT3的表达,观察人参皂甙Rg1、Rb1对NSCs增殖的影响。另外,以传1代NSCs为研究对象,造谷氨酸毒性模型,并分为四组(正常对照组、谷氨酸毒性组、Rg1保护组、Rb1保护组),采用MTT和台盼蓝排斥试验检测各组细胞存活率、TUNEL试验检测各组细胞凋亡率,用免疫细胞化学法检测各组细胞STAT3的表达,观察人参皂甙Rg1、Rb1对NSCs的保护作用。结果如下: 一、人参皂甙Rg1、Rb1对神经干细胞增殖的影响 1.用倒置显微镜观察细胞生长:在培养的第1-4天,各组细胞悬浮生长,单细胞不断分裂成细胞球,细胞密度逐渐加大,折光性好,Rg1和Rb1处理组NSCs的分裂、增殖比对照组更快,第4天细胞增殖达到高峰;并且发现NSCs的生长与Rg1和Rb1的浓度有关,当Rg1、Rb1浓度为40uM时,细胞球分裂、增殖能力最强。当各组细胞培养液中加入5%小牛血清2小时后,悬浮生长的细胞就开始贴壁、分化,第3天时,Rg1和Rb1组分化细胞突起的密度和长度(单位:um)(Rg1:142.60±1.32;Rb1:143.59±1.86)与对照组(145.11±0.95)相比,无统计学差异;其GFAP(星形胶质细胞标志)和β-Tublin(神经元标志)阳性细胞百分率分别为(Rg1:55.38%;Rb1:56.98%)和(Rg1:32.81%;Rb1:34.53%),与对照组(57.31%和33.24%)相比也无统计学差异。 2.用细胞计数法检测克隆数:各浓度组人参皂甙Rg1、Rb1均能促进NSCs克隆平均数增加,除个别浓度组(Rg1:160uM;Rb1:5、160uM)外,绝大多数浓度组促进NSCs克隆平均数增加程度,与对照组比相差显著(P<0.05),其中40uM组促进NSCs增殖作用最强,并且在第四天时细胞增殖克隆平均数(单位:个)(Rg1:52;Rb1:35)达到高峰,与对照组(24)相差非常显著(P<0.01)。Rg1和Rb1各对应浓度组细胞增殖克隆平均数比较,差异显著(P<0.05)。 3.用MTT法检测增殖率:在第4天检测Rg1和Rb1 10-160uM各组NSCs增殖率(RG1组分别为26.23%、32.13%、86.23%、51.32%、33.11%;RB1组分别为82.95%、195.41%、91.25%、58.03%、51.14%),与5uM组(RG1组:10.16%;RB1组:16.72%)比较,差异非常显著(P<0.01)。RG1与RB1各对应组间比较,差异也非常显著(P<0.01)。 4.用免疫细胞化学法检测STAT3的表达:应用Rg1和Rb1(40uM)组NSCs表达STAT3阳性细胞百分比(Rg1组:61.62%、Rb1组:58.65%),与对照组比较(32.32%)差异非常显著(P<0.01)。Rg1与Rb1组间比较,无统计学差异。 二、人参皂甙Rg1、Rb1对神经干细胞谷氨酸损伤的保护作用 1.用倒置显微镜观察细胞形态:谷氨酸毒性组细胞折光性差,胞体肿胀、部分细胞碎裂,有大量的细胞碎屑,仅少量细胞存活。Rg1和Rb1保护组细胞折光性均较好,绝大多数细胞胞体完整、细胞很少碎裂、碎屑也很少。 2.用台盼蓝排斥试验检测存活率:台盼蓝使死亡细胞着蓝色,而活细胞不着色。谷氨酸毒性组多数细胞碎裂、坏死,仅少部分细胞存活,台盼蓝使谷氨酸毒性组大多数细胞着蓝色,细胞存活率为11.3%,而Rg1保护组和Rb1保护组细胞大多数未着色,细胞存活率为58.6%和62.3%,与谷氨酸毒性组比较,差异显著(P<0.01)。Rg1和Rb1保护组间比较无统计学差异。 3.用MTT法检测OD值:通过测定活细胞在570nm波长处吸光度,可反映细胞活性,从而检测Rg1、Rb1对谷氨酸毒性组的保护作用。正常对照组细胞的OD值为0.325±0.062,谷氨酸毒性组细胞的OD值为0.200±0.031,两组比较,差异非常显著(P<0.01),表明谷氨酸毒性组活细胞数显著减少;加入Rg1和Rb1保护后,细胞的OD值明显提高,分别为0.285±0.041和0.276±0.019,与谷氨酸毒性组比较,差异非常显著(P<0.01)。Rb1与Rg1保护组间比较无统计学差异。 4.用TUNEL法检测凋亡率:谷氨酸毒性组存活细胞中多数细胞染成棕褐色,即凋亡细胞,细胞凋亡率为65.3%,而Rg1保护组和Rb1保护组大多数细胞存活,仅少部分细胞染成深褐色或棕褐色,细胞凋亡率为21.6%和20.2%,与谷氨酸毒性组比较,差异非常显著(P<0.01)。Rb1与Rg1保护组间比较无统计学差异。 5.用免疫细胞化学法检测STAT3的表达:用免疫细胞化学法检测谷氨酸毒性组大多数细胞融合再一起,形成细胞团,很少表达STAT3,其阳性细胞百分比为4.52%;Rg1保护组,大多数细胞分散,并表达STAT3,其阳性细胞百分比为30.81%,与谷氨酸毒性组比较,差异显著(P<0.01)。Rb1保护组阳性细胞百分比为29.83%,与Rg1保护组相比无统计学差异。 结论: 1.人参皂甙Rg1、Rb1能够促进SVZa NSCs的增殖:人参皂甙Rg1、Rb1促进SVZa NSCs增殖的最佳浓度为40uM,最佳时间为第四天,其机制可能是通过促进STAT3阳性细胞百分率的表达而使NSCs增殖。 2.人参皂甙Rg1、Rb1对谷氨酸中毒的SVZa NSCs具有保护作用:高浓度谷氨酸可使SVZa NSCs中毒;人参皂甙Rg1和Rb1能使中毒的NSCs形态和数量较好地恢复;人参皂甙Rg1和Rb1抗谷氨酸毒性作用可能与增加STAT3阳性细胞百分率的表达有关;人参皂甙Rg1和Rb1通过对抗谷氨酸毒性,发挥保护作用。 3.人参皂甙Rg1、Rb1对SVZa NSCs的分化无明显影响:初步观察发现,人参皂甙Rg1和Rb1各组分化细胞,其突起的密度和长度与对照组相比,无明显差异;其GFAP和β-Tublin阳性细胞百分率与对照组相比也无统计学差异。人参皂甙Rg1、Rb1对NSCs的分化可能无明显影响,此结论尚需进一步研究来证实。 通过选用价廉、低毒、易通过血脑屏障的人参皂甙Rg1和Rb1,对SVZa NSCs增殖和保护作用进行研究,发现Rg1和Rb1能促进NSCs的增殖,并通过对抗谷氨酸毒性作用,使SVZa NSCs得到保护,其机制可能与促进STAT3阳性细胞百分率的表达有关;未发现Rg1和Rb1对NSCs分化的影响。本研究为CNS疾病及损伤的修复研究和人参的临床应用提供了理论参考。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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