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《第三军医大学》 2007年
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环境内分泌干扰物壬基酚快速生物检测技术研究

杜志辉  
【摘要】: 壬基酚是已经确认的环境内分泌干扰物之一,且在环境中的污染状况不容乐观,对其进行监测和评估是环境监测和治理的一项重要内容。使用仪器进行检测虽然准确,但费时、操作复杂、成本高。本实验的主要目的是研究壬基酚的快速、简便、低成本的生物检测技术。 利用有机化学方法通过曼尼赫反应使壬基酚酚羟基临位上的活泼氢被羰基取代,再与载体蛋白的氨基进行结合,制备出壬基酚-蛋白结合物。通过测定吸光度值变化并计算结合比,结果显示壬基酚与牛血清白蛋白和卵清白蛋白的结合比分别为18:1和12:1。利用得到的壬基酚-蛋白结合物制备出壬基酚多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验测定其效价为1:78125。采用棋盘滴定实验确定ELISA测定样品最适条件,对标准系列进行测定并绘制标准曲线,经计算检出限(IC90)约为8ng/ml,具有较好的特异性。 通过加热搅拌用柠檬酸钠还原氯金酸法制备纳米胶体金,经紫外可见分光光度计扫描推断其粒径大小及均一度,经场发射透射电镜观察,结果显示胶体金粒径约为19nm,且分布比较均匀。通过最适条件的摸索,确定壬基酚多克隆抗体与胶体金进行有效结合的最适pH为7.6,最适蛋白加入量为每毫升胶体金加入24μg抗体。根据上述条件制备免疫胶体金并对制备过程进行监测,经渗滤实验证明结合物具有免疫活性,确认结合成功。 经比较实验,确定胶体金结合释放垫为上海金标生物科技有限公司型号为SB06的玻璃膜,该膜上喷涂的免疫胶体金中壬基酚抗体浓度约为48μg/ml,层析材料为密理博(Millipore)公司型号为HFB1350220的硝酸纤维素膜,检测线(NP-OVA)划线浓度为0.52mg/ml,质控线划线浓度为羊抗兔IgG稀释10倍。用制得的免疫层析试纸条检测已知含有壬基酚的样品10个,灵敏度为(4.4±2.5)μg/ml,在4℃并加入干燥剂密封的情况下储存6个月能保持原有的检测灵敏度不变。试纸条在10min左右出现清晰的条带,检测时间短,稳定性良好,符合快速检测要求,能够实现壬基酚污染事故的快速定性检测。 本实验探索的ELISA法和试纸法与传统的气相色谱法相比,检测壬基酚时无需进行样品前处理,检测时间相对较短,操作简单,费用较低,其中ELISA法的检测灵敏度达到国外同类产品(10ng/ml)的水平,免疫层析试纸法的检测灵敏度接近国内报道的免疫生物芯片技术{(0.16~5.10)μg/ml}的检测灵敏度。虽然两种快速检测壬基酚方法的检测灵敏度与色谱法相比还有差距,但以牺牲部分灵敏度来达到快速检测的目的,还是有一定的现实意义。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:X830

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