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《第三军医大学》 2007年
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大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞诱导分化和体内移植研究

刘东宁  
【摘要】: 视网膜变性疾病是严重的致盲眼病,引起视力丧失的主要原因是视网膜神经细胞的不可逆损伤,目前临床上还没有有效的方法能阻止病变进展和恢复视网膜功能。干细胞移植治疗神经损伤和神经系统退行性病变疾病是医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。其中骨髓间充质干细胞( bone marrow stromal cells , BMSCs)作为一种多潜能的成体干细胞,可以直接从病人自体骨髓中获得,并在体外大量增殖,同时可以避免异体和异种移植无法避免的免疫排斥问题,是目前干细胞移植研究的焦点。近年研究发现,BMSCs具有跨系统、跨胚层分化的潜能,在不同的诱导剂作用下,可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等多种中胚层来源的间质细胞和内胚层的肝细胞,还可分化为外胚层的神经祖细胞、神经细胞等。因此,BMSCs是未来用于干细胞移植治疗具有临床应用前景的种子细胞。 目前,诱导BMSCs向视网膜神经细胞分化的研究刚刚起步,主要集中在以下两方面:一是采用共培养方法模拟视网膜的局部微环境进行诱导。二是采用细胞因子进行化学性诱导。鼠视网膜神经细胞的发生大致经历胚胎期和新生期两个阶段。新生阶段是鼠视网膜发育分化的第2个高峰期,存在大量未分化的细胞,是视杆细胞分化形成的主要阶段,提示新生鼠视网膜微环境内可能存在促进干细胞分化的多种细胞因子和细胞外基质成分。研究显示,视网膜干细胞与新生鼠视网膜神经细胞共培养后,能较多地分化为视杆细胞,BMSCs与新生鼠视网膜神经细胞共培养后可以获得视网膜神经节细胞特异性标记物Thy1.1表达阳性的细胞,但与新生鼠视网膜神经细胞共培养是否能诱导BMSCs分化为视杆细胞和其他视网膜神经细胞,目前尚不清楚。在诱导BMSCs分化为神经细胞的化学性诱导方法中,bFGF诱导方法是常用的一种经典方法,与其他化学性诱导方法相比,bFGF诱导的优点在于可以获得较高的神经细胞分化率。此外,bFGF联合细胞因子BDNF、NGF可以诱导BMSCs分化为以视杆细胞为主的视网膜神经细胞,但bFGF诱导是否直接诱导BMSCs分化为以视杆细胞为主的多种视网膜神经细胞,共培养微环境诱导和化学性诱导对BMSCs向视网膜神经细胞的分化效率有何不同,目前未见报道。国内外一些学者将未诱导BMSCs直接移植至视网膜变性大鼠和激光损伤大鼠的视网膜下腔,可以观察到移植细胞在视网膜下腔存活、迁移并整合于宿主视网膜,细胞移植后宿主视网膜功能得到一定的改善,但直接移植的BMSCs迁移能力都偏低,分化为视网膜神经细胞的功能也不强。而BMSCs先进行体外诱导分化后,是否有利于提高其在宿主视网膜内存活、迁移和分化的能力,同时更好地改善宿主的视功能,还有待研究。 基于上述的研究现状,本研究采用新生鼠视网膜神经细胞共培养和bFGF化学性诱导两种方法对BMSCs进行诱导,观察并对比两种方法对诱导后细胞向视网膜神经细胞方向分化的不同影响。在此基础上,将BMSCs经体外先行诱导分化后的混合细胞和未诱导的BMSCs分别移植至变性大鼠的视网膜下腔,观察并对比两种策略所移植的细胞在变性视网膜内的存活、迁移和分化,及其挽救变性视网膜的光感受器细胞的和改善视功能重建情况。本研究分为三个部分: 第一部分:大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及细胞特性研究 30d龄Long-Evans大鼠股骨来源的骨髓间充质干细胞分离、培养,并对其进行鉴定和生物学特性检测。 成功建立成年Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs的培养方法,原代培养细胞生长良好,7-10天融合成单层。传代后细胞呈均一的成纤维细胞样,经流式细胞仪检测纯度高达90%以上,生长良好,可以在体外大量扩增,具有干细胞的多向分化潜能。 第二部分:大鼠BMSCs诱导分化为视网膜神经细胞的体外研究 分别采用Transwell分隔共培养系统和bFGF化学诱导法对BMSCs进行诱导,观察不同诱导方法的诱导效率,以生长培养基DMEM/F12+10%FBS为对照组。结果显示: 1.大鼠BMSCs与新生鼠视网膜神经细胞共培养后,随着时间延长,神经元样细胞逐渐增多。诱导后细胞可表达成熟神经元(MAP-2)、视网膜神经节细胞(Thy1.1)和视杆细胞(opsin)的标记物,而不表达双极细胞(PKCα)和神经胶质细胞(GFAP)标记物。诱导后5天MAP-2,Thy1.1阳性率最高,分别为10.8%和3.8%,与其他时间点相比差别具有统计学意义(P0.01)。opsin阳性细胞出现在诱导后5天,阳性率为1.9%,与诱导后7天相比差别具有统计学意义(P0.01)。 2.大鼠BMSCs经bFGF诱导后,在1天时绝大多数细胞即呈现神经元样改变,但随着诱导时间延长,神经元样细胞大量脱落。诱导后细胞表达MAP-2、Thy1.1和opsin,不表达PKCα和GFAP。诱导后1天MAP-2,Thy1.1阳性率最高,分别为74.2%和15.6%,与其他时间点相比差别具有统计学意义(P0.01)。opsin表达阳性的细胞仅出现在诱导后1天,阳性率为2.3%。 3.对照组BMSCs未发生形态变化,MAP-2,Thy1.1,opsin,PKCα和GFAP表达均为阴性。 4.在诱导的不同时间点,bFGF诱导组MAP-2和Thy1.1的阳性率均显著高于共培养诱导组(P0.01)。bFGF诱导组仅在诱导后1d出现opsin表达阳性的细胞,而共培养诱导组在诱导5d时才出现opsin阳性的细胞。BMSCs经bFGF诱导后,随着诱导时间的延长,多数细胞脱落,存留的贴壁细胞显著少于共培养诱导组(P0.01)。 第三部分:骨髓间充质干细胞经体外bFGF诱导后移植至RCS大鼠视网膜下腔后的存活、迁移、分化及其对视功能的改善 将DiI荧光标记的未诱导BMSCs和bFGF诱导后1天的混合细胞(包含BMSCs,已表型分化的神经元和视网膜神经细胞)分别移植入RCS大鼠的视网膜下腔,以RCS-rdy大鼠作为正常对照,观察移植后不同时间点,移植细胞在宿主视网膜下腔存活、迁移和分化情况,以及对变性视网膜光感受器细胞的挽救作用和对视功能的改善。结果显示: 1.未诱导的BMSCs和bFGF诱导后的混合细胞分别移植至RCS大鼠和正常对照大鼠视网膜下腔后,均可至少存活至移植后3个月。两种细胞移植后在RCS大鼠视网膜内存活细胞数均显著多于正常对照大鼠视网膜(P0.05)。在移植后3个月,bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜和正常对照视网膜内存活的细胞多于未诱导BMSCs移植组(P0.05, P0.01)。 2.未诱导BMSCs直接移植后,在RCS大鼠视网膜内3个月迁移至内核层和神经节细胞层,在正常对照大鼠视网膜内主要存在于视网膜下腔,少数移植细胞迁移至内核层。在移植后1个月和2个月,未诱导BMSCs在RCS大鼠视网膜内迁移距离高于正常对照大鼠(P0.05, P0.01)。bFGF诱导后的混合细胞移植后,在RCS大鼠视网膜内2个月即迁移至神经节细胞层,而在正常对照大鼠视网膜内3个月时偶见移植细胞迁移至神经节细胞层。在移植后1个月和2个月,bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜内迁移距离高于正常对照大鼠(P0.05, P0.01)。在移植后不同时间点,bFGF诱导后混合细胞在RCS大鼠视网膜内迁移距离均显著高于未诱导BMSCs(P0.01)。 3.未诱导的BMSCs在RCS大鼠视网膜内可以表达Thy1.1,opsin,PKCα和GFAP,在正常对照大鼠视网膜内,仅1个月时表达GFAP。bFGF诱导后的混合细胞在RCS大鼠视网膜内,仅在1个月时表达Thy1.1和GFAP,在正常对照大鼠视网膜内仅在1个月时表达GFAP。 4.未诱导的BMSCs和bFGF诱导后1天的混合细胞移植至变性视网膜下腔后均能延缓光感受器细胞变性,外核层存留的细胞层数显著多于伪手术组(P0.05)。Rod-ERGb波在移植后1个月比伪手术组潜时缩短,幅值增加(P0.05),Max-ERG b波在移植后1个月和2个月幅值增加(P0.05)。而在移植后3个月Rod-ERG和Max-ERG b波潜时和幅值均无明显改善(P0.05)。未诱导的BMSCs和bFGF诱导1天的BMSCs之间对变性视网膜的外核层存留和F-ERG功能改善没有显著差别(P0.05)。 结论: 1.建立了具有高纯度和良好生物学特性的成年Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs培养体系,扩展了BMSCs在眼科基础研究中的应用范围; 2.bFGF化学性诱导和新生鼠视网膜神经细胞共培养均能诱导大鼠BMSCs分化为神经元、视网膜神经节细胞和视杆细胞;新生鼠视网膜微环境有利于诱导后细胞存活,但在短时间内诱导效率较低。而bFGF化学性诱导具有短时间内诱导大鼠BMSCs向神经元和视网膜神经细胞分化的优势,这为未来BMSCs应用于临床进行视网膜移植,使患者尽可能在短时间内获得有效治疗提供了一种新方法; 3.BMSCs在体外经bFGF诱导后进行移植,存活和迁移能力增强,分化能力较弱,可延缓RCS大鼠视网膜光感受器细胞变性,在移植后1个月和2个月可部分改善宿主视功能,而在移植后3个月,不能挽救宿主视功能。这为未来视网膜移植如何进一步优化BMSCs,获得理想的诱导和移植策略,进而重建视功能,提供了一个新的思考方向。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R774.1

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