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《第三军医大学》 2007年
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LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究

赵海生  
【摘要】: 【背景】提高损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)存活和再生能力的研究是眼科和神经生物学科共同关注的热点和焦点。具有神经保护性效能的神经营养因子是实现视觉系统中枢神经修复基因治疗和移植的前提和物质基础。然而,既往的研究多集中在某种生长和营养因子的单一研究,迄今为止,还未能找到一种因子能对RGC提供持续的营养支持作用足以克服其周围的再生抑制环境而促进损伤的轴突再生。如果能寻找到某种在转录水平或转录前作用的因子,则该因子有可能启动RGC生长的极链式反应,轴突再生的难题也就迎刃而解了。晶状体来源的上皮生长因子(lens epithelium derived growth factor, LEDGF)是2000年新发现的一种新的生长、粘附、分化、抗凋亡和存活因子,它能提高多数细胞生长粘附能力、促进其分化、延长其存活。LEDGF基因位于人类染色体9p21,该基因选择性的剪切而产生两种蛋白,即LEDGFp75和LEDGFp52蛋白。相比LEDGFp52而言,LEDGFp75只是一个弱的转录辅活化子。最近的研究表明LEDGFp75能促进多种细胞的生长与存活,譬如对晶状体上皮细胞、视网膜光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞所发挥的生长刺激和促进存活效应。进一步的研究发现LEDGF在脑内的发育及区域表达,提示其参与神经上皮干细胞分化及神经发生。因此,有专家提议将LEDGF作为视网膜疾病的治疗性蛋白和神经营养因子转染的候选分子。基于LEDGFp75具有一定的眼部保护作用的研究前提、联系LEDGFp52可能比LEDGp75生物学作用更强的生物信息学预测、结合国际上对LEDGFp52这一转录活化子研究很少的事实和视神经再生研究中积极寻找具有神经保护和生长促进效能神经营养因子的要求,我们选择LEDGFp52作为研究的目标。那么,LEDGFp52作为一个新发现的因子,它是否能对RGC起到神经保护和生长促进作用呢?它对RGC神经元生长相关基因和蛋白又有什么影响呢?这有待于我们通过实验研究来明确。 【目的】在原代大鼠RGCs培养的基础上进行LEDGFp52基因和蛋白两个水平正负双向调控实验,观察它们对大鼠RGCs突起数目及轴突长度、RGC神经元特异性相关基因和蛋白的调控,全面了解LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs生长的影响,为研发更有效的RGC生长和营养因子奠定基础,为探索视神经损伤修复的新途径提供实验依据。 【方法】NEUROBASALTM Media无血清体系培养RGCs,采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测LEDGFp52基因和蛋白在RGCs表达;构建rhLEDGFp52基因原核表达载体、诱导表达及纯化蛋白;细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体、体外表达及制备病毒;构建siRNA-LEDGFp52真核表达载体、鉴定该载体并检测其对LEDGFp52蛋白的抑制率。 1、LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs的突起数目及轴突长度调控作用的观察:分为实验组和对照组,实验组在大鼠RGCs培养36h后分别将LEDGFp52(2×10-4g/L)和Ab-LEDGF(2.5×10-4g/L)加入RGCs的无血清培养基中,在LipofectamineTM2000介导下将Ad-LEDGFp52(2.5×10-4g/L)(3×10-4pfu/L)和siRNA-LEDGFp52(6×10-4g/L)转染进RGC,分别在处理后12h、24h、36h、48h、72h和96h在相差显微镜下观察。设阳性对照组(CNTF10-4g/L)和空白对照组(不加处理因素),观察时相点同上。对照组及实验组的每组观察孔数为12孔,重复3次。检测指标:RGCs轴突长度和单个细胞的突起数目。分析软件:IPP图像分析系统。 2、LEDGFp52基因和蛋白对RGC神经元生长相关基因和蛋白调控效应的研究:处理因素及分组同上。检测指标:主要采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测技术进一步研究LEDGFp52对RGC神经元生长相关的GAP-43、NF-L和MAP-2基因与蛋白的调控。分析软件:Quantity One程序半定量分析各个目的基因在mRNA水平的相对含量,以待测基因与相应内参照光密度比值计算相对系数;LSM510-Meta-Expert程序半定量分析各个目的蛋白的平均荧光强度相对数值。 【结果】 1、无血清的NEUROBASALTM Media培养基是一种较好的RGCs培养体系;LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs均有表达。 2、利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确,通过IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%。Western Blot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,终浓度达520μg.mL-1,分析其纯度达87.93%。 3、成功将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52,并将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因重组腺病毒载体pAd-LEDGFp52,将pAd-LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,滴度可达5×1012 pfu.L-1。将Ad-LEDGFp52体外转染293细胞,在该细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,CPE法及Westernblot均证实了该目的基因表达。 4、成功构建LEDGFp52基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体,重组质粒转染HeLa细胞48小时,Westernblotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变,Quantity One程序半定量分析LEDGFp52蛋白明显下调了70%。 5、LEDGFp52在基因水平和蛋白水平均可调控RGCs生长,表现为正向调节RGCs轴突显著增长,负向调节RGCs轴突显著缩短,而且正向调控时有高峰效应。 6、LEDGFp52是RGC树突化因子,同时也是RGC轴突延伸因子。 7、LEDGFp52在基因和蛋白两个水平对RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达均有显著的调控作用,表现为正向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达升高,负向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达降低。 【结论】 1.首次确立了LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs的表达。 2.利用基因重组技术成功获得rhLEDGFp52蛋白,终浓度达520μg.mL-1,纯度达87.93%;经细菌内同源重组成功制备LEDGFp52的重组腺病毒,滴度可达5×1012 pfu.L-1,并能够在真核细胞中获得高效稳定的表达;利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体,该重组体使LEDGFp52蛋白明显下调70%。 3. LEDGFp52基因和蛋白能显著调控大鼠RGCs单个细胞突起数目及轴突平均长度,其作用强于CNTF。 4. LEDGFp52是RGC树突化因子,也是RGC轴突延伸因子。 5. LEDGFp52基因和蛋白通过调控RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达促进RGC生长。 6. LEDGFp52基因在调控RGC树突化时有其它树突化因子的参与。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R774.1

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【参考文献】
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