收藏本站
《第三军医大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

NOV基因真核表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞成神经分化中的作用研究

刘雁平  
【摘要】: 中枢神经系统(central nervous system,CNS)的损伤修复一直是困扰神经科学工作者的大难题。传统观念认为中枢神经系统一旦损伤便不能恢复。近20年来随着神经科学的发展,尤其是干细胞的出现使人们观念发生改变,逐渐认识到成年CNS再生是由神经元的固有特性(intrinsic properties)和其所处的环境(environmental cues)共同决定的。因此增加受损神经元的再生潜能,改善轴突再生的微环境成为CNS损伤修复的基点。 神经损伤后修复的难点之一是神经元再生困难,近年来随着干细胞研究的迅猛发展,组织和细胞移植治疗成为大家最为关注的方法之一。选择合适的种子细胞是细胞移植最核心的问题。目前用于移植的细胞供体主要是胚胎干细胞、神经干细胞(neural stem cells,NSC)、来源于神经系统的具有促神经再生作用的细胞(如神经膜细胞、少突胶质细胞、嗅鞘细胞等),以及其他具有成神经分化潜能的成体干细胞。尽管这些细胞在CNS损伤修复移植治疗中均显示出不同程度的积极作用,但由于细胞来源局限、取材不易、免疫排斥以及伦理道德等诸多方面的问题,临床应用受到很大限制。因此,寻找新的种子细胞来源成为当务之急。皮肤是人体最大的器官,包括来源于三个胚层的多种不同的组织细胞,自我更新和再生修复速度快,是成体干细胞分离和研究的良好对象。真皮多能干细胞(Dermal multipotent stem cells,DMSCs)是一种新近分离成功的具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞,具有分化为脂肪细胞、肌细胞及神经细胞的能力。相对于其他移植供体细胞而言,DMSCs具有来源丰富、容易获得、可自体移植、具有更少的“谱系倾向性”等优点。避免了胚胎伦理学、来源不足、异体排斥等弊端。更有研究表明,DMSCs移植治疗脊髓损伤时,不仅能外在补充缺失神经元,同时可通过分化产生Schwann cells促进轴突再生及髓鞘化。显示了DMSCs在CNS损伤修复中的良好应用前景,有望成为细胞移植及组织工程的新宠。 在神经损伤修复中,除细胞移植外在补充缺失神经元外,利用基因工程方法改善损伤局部微环境是治疗的另一个侧重点。肾母细胞瘤过度表达基因(Nephroblastoma Overexpression gene,NOV)是1991年发现的一种原癌基因,其所编码产物(NOV蛋白)是一种胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)相关蛋白(IGF-relation proteins, IGF-rPs ),属于IGF超家族的成员。NOV基因是神经系统发育的一个调控因子,与动物CNS的损伤和修复之间存在一定的关系。NOV基因可通过IGF依赖或者非依赖的方式发挥作用,参与CNS损伤后的再生和修复过程。NOV基因的真核表达载体可以表达和释放NOV蛋白,促进内源和外源性NSC向神经元的分化,为CNS再生修复提供合适的微环境。NOV基因及其蛋白对DMSCs是否具有类似作用尚未见相关报道。 拟将DMSCs作为种子细胞携载NOV基因进入体内,不但能外在补充CNS损伤中缺失的神经元,同时在体发挥改善损伤局部微环境的生物学效应,结合NOV基因治疗及DMSCs细胞移植治疗双重优势用于CNS的损伤修复,是本实验的基本设计思路。为此本文进行了如下研究:(1)含NOV基因的全长序列的真核表达载体的构建和表达;(2)大鼠真皮来源多能干细胞的分离培养和鉴定;(3)观察NOV基因及其分泌蛋白对DMSCs增殖和成神经分化的影响。通过该项研究为结合NOV基因工程及DMSCs细胞移植用于CNS的损伤修复治疗提供初步离体实验资料。 研究的主要结果及结论概述如下: 1、利用RT-PCR的产物,采用定向克隆的方法,通过中间载体pMD-19T,成功地将NOV cDNA全长序列克隆到pEGFP-N1真核表达质粒上,构建了pEGFP-N1/NOV融合表达载体,用抗性菌落筛选、质粒酶切鉴定、插入片段序列分析等方法,证明获得的重组质粒完全符合设计要求,为进一步的NOV基因功能研究提供分子平台。 2、利用早期贴壁传代培养方法,从新生大鼠真皮中分离培养多能干细胞,该细胞经流式细胞仪检测细胞周期、MTT法测定生长曲线具有良好的自我增殖能力;在一定诱导条件下分化为神经细胞、脂肪细胞及成骨细胞,具有向外胚层及中胚层细胞分化的多能性。由此证实了大鼠真皮组织中存在着间充质干细胞,为干细胞移植治疗提供了又一新的种子细胞来源。 3、在构建了NOV基因真核表达载体的基础上,用脂质体转染法首次将该重组质粒转染入DMSCs中,流式细胞仪检测转染效率约30%。经G418筛选阳性克隆、多次传代纯化后用RT-PCR法检测到NOV重组质粒在DMSCs中稳定表达。表明DMSCs可作为NOV基因的细胞载体。 4、通过细胞形态学观察、流式细胞仪及MTT法研究NOV基因转染对DMSCs增殖性的影响,发现转染了NOV基因的DMSCs较对照组细胞G0/G1期细胞比例下降,细胞倍增时间提前,增殖能力提高一倍。提示NOV基因能刺激DMSCs的增殖。 5、收集培养NOV/DMSCs细胞的条件培养液(NOV-CM),结合细胞形态学变化及免疫细胞化学法,研究NOV基因及其分泌蛋白对DMSCs分化的影响,结果显示NOV-CM可以促进DMSCs向神经元方向分化,分化细胞中神经元比例增高,且细胞突起较对照组明显延长。NOV基因转染亦具有同样的作用。 综上所述,我们准确的构建了含NOV基因全长序列的真核表达载体,成功分离、培养并鉴定了新生大鼠真皮多能干细胞。在此基础上,采用脂质体法首次将该重组质粒转染至DMSCs中,并且NOV基因在其中稳定表达。进一步的研究表明NOV基因及其分泌蛋白可以显著提高DMSCs增殖性、促进DMSCs向神经元方向分化并有助于突起形成。该实验结果提示DMSCs不仅可作为一种新的种子细胞来源,且携载了NOV基因的DMSCs具有细胞移植及基因工程双重优势,不但外在补充缺失神经元,同时可改善损伤局部微环境,有望在神经系统损伤修复中发挥作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R329

手机知网App
【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 席照房;ARC及IGF-1在AS肉鸡中抗心肌细胞凋亡作用的研究[D];华中农业大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 李成仁,李巍,蔡文琴,苏炳银,陈德英;NOV对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响[J];第三军医大学学报;2003年01期
2 李成仁,李巍,蔡文琴,苏炳银,陈德英;NOV基因修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能恢复的影响[J];第三军医大学学报;2003年01期
3 SHIChunmeng,263.net) ,CHENGTianmin,263.net) ,SUYongping,263.net);Exploring the developmental potential of adult mammalian somatic cells[J];Chinese Science Bulletin;2001年01期
4 刘雁平;李露斯;王涛;罗晓红;李自方;;真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究[J];西南国防医药;2008年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 申勋宇;;重金属铅对鲫鱼血清抗氧化能力的影响[J];安徽农业科学;2010年02期
2 晏容;刘流;刘晖;贺莉芳;;大肠杆菌感染后家蝇幼虫血细胞中ACP和POD活性的变化[J];安徽农业科学;2011年21期
3 谭苹;杨建明;肖瑞芬;张艳;;紫红链霉菌对钉螺酶组织化学的影响[J];动物学报;2006年01期
4 孙虎山,王宜艳,杨静,孙修勤;病毒感染对栉孔扇贝血淋巴中过氧化氢酶和过氧化物酶活力的影响[J];水产科学;2004年08期
5 曾鹏;孙虎山;王宜艳;韩强;冉镇;;虾夷扇贝胚胎及早期幼虫酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的组织化学研究[J];水产科学;2007年01期
6 李成仁;蔡文琴;;脊髓损伤的干细胞移植治疗[J];重庆医学;2006年15期
7 郭庆山,王爱民,杜全印,孙红振;提高周围神经移植修复脊髓损伤能力的实验研究[J];创伤外科杂志;2002年06期
8 陈永福,贾连顺;脊髓再生研究的进展和前景[J];第二军医大学学报;2000年07期
9 王庆恒;师尚丽;邓岳文;杜晓东;;裸体方格星虫壶状细胞复合体的形态结构[J];海洋学研究;2010年02期
10 方富贵,章孝荣;P物质研究进展[J];动物医学进展;2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 唐巍;;从中医脑髓理论探讨缺血性脑卒中后内源性神经功能修复[A];中医药理论与应用研究——安徽中医药继承与创新博士科技论坛论文集[C];2008年
2 李龙;李春莲;曾家顺;夏露;;佐剂性关节炎大鼠滑膜E2F-1、RB的表达及益赛普对其影响[A];贵州省医学会风湿病学分会第四届学术年会专题论文汇编[C];2010年
3 包慧君;徐春生;张莉;李梅英;陈秋生;;中华鳖脾脏椭球高内皮毛细血管的发现及淋巴细胞迁移的细胞学基础[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙晓芳;三七总皂苷防治博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的实验研究[D];北京中医药大学;2011年
2 王策;膈神经端侧吻合迷走神经重建高位颈髓损伤后呼吸功能的研究[D];第二军医大学;2011年
3 刘问;白斑综合征病毒对锯缘青蟹的致病性及致病机理研究[D];宁波大学;2010年
4 包慧君;中华鳖肠道、脾脏和脑垂体的主要功能细胞学研究[D];南京农业大学;2010年
5 张秀英;NDGA与去细胞肌肉支架及AECs联合治疗大鼠脊髓损伤的研究[D];吉林大学;2012年
6 吴中亮;中枢神经损伤与修复的研究[D];第四军医大学;2002年
7 程映华;神经干细胞修复脊髓损伤的组织工程学研究[D];苏州大学;2002年
8 赵炜;痛块消巴布剂制剂工艺及治疗癌痛的临床和机理研究[D];北京中医药大学;2003年
9 马海涵;新生大鼠半横切脊髓内胚胎脊髓移植后大脑皮层cDNA差示文库构建及部分相关基因分析[D];第三军医大学;2003年
10 周许辉;高位颈髓损伤大鼠呼吸功能重建的研究[D];第二军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张昱;中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)脊髓急性损伤后细胞凋亡初步研究[D];安徽师范大学;2010年
2 龙志晶;干扰Hes1基因对骨髓基质细胞向胆碱能神经元分化前期的影响[D];山西医科大学;2011年
3 王兰梅;TGFβ1基因多态性及血清浓度对先心病心肌纤维化的相关性研究[D];中南大学;2011年
4 沈盛晖;外周血CGRP、SP水平及HRV与冠状动脉粥样硬化病变的关系研究[D];浙江大学;2011年
5 张正昊;应用荧光原位杂交技术监测白血病患者微小残留病的临床研究[D];新疆医科大学;2011年
6 黄林生;鸡胚真皮间充质干/祖细胞分离培养与诱导分化研究[D];湖南农业大学;2011年
7 孟志强;甲泼尼松龙预干预脊髓缺血再灌注损伤对Caspase-3表达的影响[D];郑州大学;2011年
8 杨祎程;绵羊小肠黏膜相关淋巴组织与其抗贝氏莫尼茨绦虫感染能力的研究[D];甘肃农业大学;2011年
9 朱进;皮肤来源前体细胞的分离、培养及其分化过程中基因表达变化的初步研究[D];华中科技大学;2011年
10 倪博文;骨髓间充质干细胞移植联用促细胞生长物质对大鼠脊髓损伤后期修复的影响[D];青岛大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 周利青;王文魁;齐永华;;肉鸡腹水综合征发生率与自由基代谢的关系及中药口服液对其的影响[J];当代畜牧;2005年06期
2 刘建军,杨友才,朱铨英,顾科民,谭世杰;心肌细胞培养及其方法的改进[J];第二军医大学学报;1987年05期
3 何诚,梁礼成,赵德明,夏国良,刘健华;肉鸡腹水症发病机理的研究 Ⅲ.低温对肉鸡心功能和心室结构的影响[J];动物医学进展;2001年01期
4 齐永华,王文魁;肉鸡腹水综合征研究进展[J];动物医学进展;2003年03期
5 何诚,梁礼成,罗伏兵,郝力力,夏国良;肉鸡腹水综合征发病机理与防治研究进展[J];动物医学进展;2003年05期
6 王丁科;阎萍;梁春年;曾玉峰;裴杰;;胰岛素样生长因子2研究进展[J];动物医学进展;2008年07期
7 段宇;胰岛素样生长因子-1研究进展[J];国外医学.内分泌学分册;2001年06期
8 陈继兰;与肉鸡腹水综合征有关的营养因子研究[J];国外畜牧科技;1994年04期
9 王荣湖;杨建彬;;肉鸡腹水综合征的综合防制[J];中国畜牧兽医;2009年03期
10 邵靓;胡萌;;一氧化氮对肉鸡肺动脉高压综合征的影响[J];国外畜牧学(猪与禽);2008年04期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 程青;胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-3及瘦素与巨大儿的相关性[D];苏州大学;2008年
2 赵璟;IGF-Ⅱ、PCNA在子宫肌瘤中的表达及意义[D];中南大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 史春梦,程天民;大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养[J];第三军医大学学报;2001年09期
2 李巍,蔡文琴,姚忠祥;大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究[J];第三军医大学学报;2001年12期
3 袁文肃,赵智刚,李董,李静;胎儿真皮间充质干细胞的生物学特征和多向分化的研究[J];山东医药;2005年11期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡静;戚孟春;邹淑娟;李继华;周海孝;;重组质粒pEGFP-BMP7的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[J];华西口腔医学杂志;2005年06期
2 刘雁平;李露斯;王涛;罗晓红;;真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达[J];西北国防医学杂志;2008年03期
3 俞悦;王学浩;;人全长HGF基因真核表达载体的构建及在骨髓间充质干细胞中表达的实验研究[J];中国现代医学杂志;2006年23期
4 苏菊;王佐林;;大鼠OPN真核表达载体的构建和体外表达[J];口腔颌面外科杂志;2010年01期
5 莫毅;梁方方;檀大羡;牛向丽;陈自洪;华荣;张海英;谢丹尼;;人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达[J];中国计划生育学杂志;2011年04期
6 武鸿斌;宋燕;谢忠士;刘志毅;姜洋;柳福海;赵航;;pEGFP-C1-PTEN的构建及其在乳腺癌细胞ZR-75-1中的表达[J];山东医药;2008年12期
7 雷撼;钱桂生;梁永杰;黄桂君;吴国明;;人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达[J];同济大学学报(医学版);2006年01期
8 边莉;郭子宽;艾辉胜;王华;孟二红;吴祖泽;王立生;;HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用[J];军事医学科学院院刊;2006年04期
9 郑辉;薛松;连锋;汪永义;;人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年01期
10 邓兴力;杨智勇;董坚;王廷华;冯忠堂;徐丹;;人神经生长因子β基因克隆及其真核表达载体的构建[J];医学研究生学报;2009年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱六龙;戴尅戎;;BMP-2基因转染的间充质干细胞修复大鼠股骨节段性缺损[A];2005年浙江省骨科学术会议论文汇编[C];2005年
2 路艳蒙;傅文玉;乔东访;朴英杰;;BMP12基因转染的间充质干细胞修复肌腱损伤[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
3 张磊涛;黄洪章;曾东林;张彬;;PcDNA3.1(+)/GFP-TIMP-2的构建及其在成釉细胞瘤细胞的表达[A];第五次全国口腔颌面—头颈肿瘤学术研讨会论文汇编[C];2006年
4 李丽;马海英;马玲;于艳秋;;人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
5 李鸿宾;徐月敏;;干细胞在组织工程技术修复重建下尿路疾病中的应用[A];第十六届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2009年
6 王郡甫;许晓群;张彩;张建华;高春义;;人白细胞介素21真核表达载体的构建及其在NK92细胞中的表达[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
7 戴育成;;间充质干细胞的生物学特性和应用[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年
8 郭勇;张西正;郭春;魏严;李瑞欣;徐晓莹;张永红;;脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化中心肌发育相关基因的表达[A];天津市生物医学工程学会2008年年会暨首届生物医学工程与临床论坛论文集[C];2008年
9 张颢;陶艳玲;邱林;张伯龙;马军;陈志哲;刘拥军;韩忠朝;;一种具有免疫负调节功能的人脐带源间充质干细胞[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
10 钟启;曾慧兰;韩新爱;朱华民;朱海扬;;人脐带间充质干细胞分离培养及鉴定[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张中桥;运脾中药可降低VMN神经元的兴奋性[N];中国医药报;2006年
2 张祎凡 记者 王春;我科学家揭示神经元蛋白极性分布的新颖机制[N];科技日报;2009年
3 本报专稿 金戈;“神经元”无人战机挑战美独霸“神经”[N];世界报;2005年
4 编译 王金元;科学家揭开感同身受之谜[N];北京科技报;2006年
5 记者 白毅;我国发现神经元极性建立的新机制[N];中国医药报;2006年
6 王秋月 王琳;空军总医院采用间充质干细胞救治小脑萎缩[N];科技日报;2009年
7 陆志城;“人造大脑”将出现?[N];医药经济报;2002年
8 胡德荣;痛苦的记忆可“删除”[N];健康报;2005年
9 沈英甲;成人脑细胞仍会生长[N];科技日报;2006年
10 梁捷;寻找“妒忌”的脑区[N];21世纪经济报道;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘雁平;NOV基因真核表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞成神经分化中的作用研究[D];第三军医大学;2008年
2 李志勇;大鼠骨髓间充质干细胞牙向分化潜能的实验研究[D];四川大学;2005年
3 熊卉;转化生长因子β1基因体外转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞向纤维软骨转化实验研究[D];武汉大学;2010年
4 王涛;TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究[D];第三军医大学;2008年
5 杨礼庆;胰岛素样生长因子-1基因转染对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响[D];中国医科大学;2006年
6 朱雅姝;Flk-1~+间充质干细胞对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制研究[D];中国协和医科大学;2008年
7 祝晓;GCA-HIF-1α-GCC提高移植骨髓干细胞存活率及治疗缺血性心肌病的实验研究[D];苏州大学;2008年
8 苗宗宁;胎盘间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料在骨创伤修复中的实验研究[D];苏州大学;2010年
9 石琳;腺病毒介导的突变型人胰岛素原基因转染人脐带间充质干细胞[D];中国协和医科大学;2008年
10 郭勇;间充质干细胞向心肌细胞的分化以及工程化心肌组织的构建[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范存刚;脐带间充质干细胞神经分化的研究[D];河北医科大学;2005年
2 高杰;人骨髓间充质干细胞成骨分化特异性miRNA的筛选[D];第四军医大学;2008年
3 李国喜;人羊膜间充质干细胞的培养、分化及移植治疗脑外伤的实验研究[D];郑州大学;2006年
4 张琦;SOX9基因真核表达载体转染诱导间充质干细胞分化为类髓核细胞的研究[D];第四军医大学;2010年
5 胡鸢;缺氧诱导因子-1a基因转染人间充质干细胞的体内促血管生成作用研究[D];第三军医大学;2005年
6 李丽;人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究[D];中国医科大学;2010年
7 张茜真;人脐带间充质干细胞的分离、鉴定以及干细胞特异性转录因子诱导其重编程的研究[D];浙江理工大学;2010年
8 唐子滨;纳米级胶原基骨材料复合自体脂肪间充质干细胞用于兔后外侧脊柱融合的实验研究[D];河北医科大学;2010年
9 李克;端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间充质干细胞的实验研究[D];郑州大学;2005年
10 张福丽;间充质干细胞治疗肺动脉高压研究进展(附肺动脉高压发病机制进展)[D];山西医科大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026