hBMP-7基因修饰的骨髓间充质干细胞移植保护肾缺血再灌注损伤的实验研究

【摘要】： 背景:肾脏的缺血再灌注损伤(IRI)导致急性肾功能衰竭(ARF)的发生率很高,治疗措施也有限,死亡率大约为30%～50%,因此防治肾脏IRI具有重要的意义,各国研究者都在寻求解决办法。针对IRI的研究很多,其中关于骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对IRI肾脏的保护作用的研究是近年研究的热点。BM-MSCs移植可促进肾脏IRI的修复并改善肾功能,但是,移植的BM-MSCs数量有限,而且能到达损伤肾脏并发挥作用的BM-MSCs更少,因此, BM-MSCs的治疗作用受限。为了提高BM-MSCs的治疗作用,很多科学家采用基因治疗和细胞移植相结合的方法来进行研究,取得了一定的效果。骨形态发生蛋白-7(BMP-7)具有调控细胞增殖作用,对肾脏的发育和功能维持起着重要作用。研究表明,缺血再灌注后,肾脏BMP-7蛋白的表达明显减少,可能参与肾脏IRI的发病过程;应用外源性BMP-7基因治疗和蛋白治疗能促进肾功能的恢复,但缺乏靶向性,治疗效果有限。因此,本课题首次通过腺病毒载体将人BMP-7(hBMP-7)基因导入BM-MSCs,然后将基因修饰的BM-MSCs移植入动物体内,观测其对肾脏IRI的保护效用,并探讨其作用机制。据所查文献,目前尚未见国内外研究报道。 目的:基于单纯BM-MSCs移植治疗或BMP-7基因治疗的不足,本课题拟采用BMP-7基因治疗和BM-MSCs移植治疗结合的方法,通过腺病毒介导hBMP-7基因转染BM-MSCs,观察基因修饰的BM-MSCs移植能否发挥更好的保护肾脏IRI的作用。方法: 第一部分:Ad-hBMP-7的构建与鉴定 酶切含hBMP-7基因的pBluescript sk(+)-hBMP-7质粒,构建穿梭质粒pDC316-hBMP-7,扩增、提纯后与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre、脂质体共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组体Ad-hBMP-7,扩增、纯化后获得Ad-hBMP-7病毒液;对构建的质粒和腺病毒进行酶切、测序、ELISA和免疫组化鉴定。 第二部分:Ad-hBMP-7体外转染兔BM-MSCs以及表达产物hBMP-7的测定 采用密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离培养兔BM-MSCs,将Ad-hBMP-7转染体外培养的BM-MSCs,通过形态学和MTT法观察转染后BM-MSCs的生长情况,RT-PCR、免疫组化、Western Blot和ELISA检测目的基因hBMP-7在体外转染的BM-MSCs中的表达。 第三部分:hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植对兔肾脏IRI的保护作用 1.经兔胫骨抽取骨髓,分离培养BM-MSCs,移植前以MOI为100的腺病毒转染,并以Hoechst33342标记; 2.建立兔肾脏冷缺血再灌注损伤模型:阻断血流后利用切除肾的残端对对侧肾进行冷盐水灌注后低温保存; 3.所有实验兔随机分为6组:Ⅰ组为假手术组;Ⅱ组为IRI对照组;Ⅲ组:缺血再灌注后进行Ad-EGFP腺病毒转染的BM-MSCs移植;Ⅳ组:缺血再灌注后体内注射Ad-hBMP-7治疗;Ⅴ组:缺血再灌注后Ad-EGFP腺病毒转染的BM-MSCs移植联合Ad-hBMP-7体内注射治疗;Ⅵ组:缺血再灌注后进行Ad-hBMP-7腺病毒转染的BM-MSCs移植。 4.各组分别在缺血再灌注后第3天、第7天和第14天进行相应指标的检测。RT-PCR、ELISA和Western Blot法检测目的基因hBMP-7在兔肾脏的表达;RT-PCR和ELISA法检测兔肾脏内源性BMP-7和TGF-β1的表达;比色法测定肾脏SOD活性和MDA含量;荧光显微镜下观察肾脏Hoechst33342阳性细胞以及Hoechst33342和CK18双阳性细胞数量以了解移植的BM-MSCs在肾脏的分布及其向肾小管上皮细胞的转化情况;免疫组化染色检测肾脏Bax和Bcl-2的含量并计算两者比值;进行PCNA免疫组化染色了解肾脏细胞增殖状态;TUNEL检测肾脏细胞凋亡情况;光镜和透射电镜下观察肾脏组织的组织学结构变化;测定肾脏功能(肌酐、尿素)。 结果: 1.酶切与测序证明成功构建了穿梭质粒pDC316- hBMP-7,将其与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre、脂质体共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组体Ad-hBMP-7,扩增、纯化后获得Ad-hBMP-7病毒液,经PCR、ELISA和免疫组化鉴定,结果表明Ad-hBMP-7的构建正确;经TCID_(50)法测定制备的Ad-hBMP-7病毒液滴度为7.94×10~(10)IU/ml,可进行体内外转染实验。 2.采用密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法成功分离培养BM-MSCs,确定Ad-hBMP-7体外转染BM-MSCs的最佳MOI值为100,转染效率达90.52%。Ad-hBMP-7转染的BM-MSCs与未转染的BM-MSCs相比,细胞形态未见明显改变,生长未见明显促进或抑制,说明构建的腺病毒转染是安全的。Ad-hBMP-7转染BM-MSCs后,ELISA法检测显示其上清液中有hBMP-7蛋白的分泌,细胞免疫组化和Western Blot检测显示细胞内有hBMP-7蛋白的表达,RT-PCR检测显示细胞内有hBMP-7 mRNA的表达;未转染组均为阴性。RT-PCR法、Western Blot法和ELISA法检测到hBMP-7的表达,在第3天达到高峰,并在此较高水平维持到第7天左右,然后开始缓慢下降,持续时间超过2周,满足体内实验的要求。 3.①Hoechst33342标记BM-MSCs的方法可靠;成功建立肾脏冷缺血再灌注损伤模型,手术兔存活良好。②Ⅵ组通过RT-PCR、ELISA和western检测到hBMP-7 mRNA和蛋白在肾脏的表达,并明显高于Ⅳ组和Ⅴ组(P0.05)。③荧光显微镜下心脏、肝脏、脾脏和肺脏均未见Hoechst33342阳性细胞;肾脏组织可见Hoechst33342阳性细胞,主要分布在肾脏的肾皮-髓质交界区的肾脏皮质内区和肾脏髓质外区的肾小管组织;VI组肾脏组织内Hoechst33342阳性细胞数在移植后各时间点均高于III组和V组(P0.05)。Hoechst33342和CK18双阳性细胞代表移植的外源性BM-MSCs分化的肾小管上皮细胞,VI组肾脏组织内Hoechst33342和CK18双阳性细胞数在移植后各时间点均高于V组,差异有显著性(P0.05)。④与Ⅰ组比较,Ⅱ组肾脏BMP-7 mRNA和蛋白明显降低,TGF-β1 mRNA和蛋白明显升高(P0.05); VI组肾脏BMP-7 mRNA和蛋白高于其它缺血再灌注组,TGF-β1 mRNA和蛋白低于其它缺血再灌注组(P0.05)。与其它缺血再灌注组比较,VI组肾小管上皮细胞增殖指数(PI)、Bcl-2含量、Bcl-2/Bax比值最高,肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)、Bax含量最低(P0.05)。⑤缺血再灌注各组比较,VI组SOD活性最高,MDA含量最低(P0.05)。⑥缺血再灌注各组比较,VI组肾脏组织学改变最轻,肌酐和尿素最低(P0.05)。 结论: 1.成功构建含hBMP-7基因的重组腺病毒Ad-hBMP-7,能体外高效转染BM-MSCs而且不影响其生长增殖,可获得目的蛋白hBMP-7的有效表达; 2.成功建立肾脏冷缺血再灌注损伤模型,更符合临床移植肾的损伤实际情况,并简化了操作,减轻了对血管的损伤。 3. Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs能优先向损伤肾脏迁移,明显提高肾脏局部hBMP-7的表达,从而弥补肾脏内源性BMP-7表达降低的不足,发挥靶向性基因治疗作用; 4.与单纯BM-MSCs移植或Ad-hBMP-7基因治疗或BM-MSCs移植和Ad- hBMP-7基因联合治疗相比,Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植能更明显地减轻肾脏损伤的程度,促进损伤肾脏的修复,改善肾脏功能。Ad-hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植能更好地保护肾脏IRI与BM-MSCs和肾脏局部高表达的hBMP-7协同发挥以下作用有关:明显降低脂质过氧化反应程度,增强机体清除自由基的能力;明显促进内源性BMP-7蛋白表达的恢复,降低TGF-β1的表达;明显上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,增加Bcl-2/Bax比值,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进肾脏内源性修复;明显提高肾脏BM-MSCs的数量,并促进其转化,直接参与肾脏修复。

【关键词】：骨髓间充质干细胞 骨形成蛋白-7 细胞移植 基因治疗 肾脏 缺血再灌注损伤 修复 保护作用
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R692
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